Baltymo gryninimas

Baltymo gryninimas

Darbo tikslas

Iš kiaušinio baltymo išgryninti baltymą lizocimą katijonų mainų chromatografijos metodu.

Darbo medžiagos 1 diena

1. Kiaušinio baltymas; 2. 120 ml 0,1 M glicino/NaOH buferio, pH 10 (toliau vadinamas buferiu G); 3. 20 ml 0,5 M NaCl tirpalo buferyje G (ruošiama laboratorinio darbo metu iš buferio G ir NaCl miltelių); 4. 1,5 g karboksimetilceliuliozės (CM celiuliozės).

Darbo medžiagos 2 diena

1. Elektroforezės aparatas, turintis spaustukus, stiklus, gelio paruošimo stovelį ir elektroforezės buferio talpyklas; 2. 0,75 mm storio tarpinė; 3. 0,75 mm storio politetrafluoretileno „šukos“; 4. 30% akrilamido/0,8% N,N’-metilenbisakrilamido tirpalas; 5. 4X TRIS⋅HCl/NDS buferis pH 6,8; 6. 4X TRIS⋅HCl/NDS buferis pH 8,8; 7. Baltymų denatūravimo (pavyzdžio) buferis (1X, 2X, 4X arba 6X); 8. 10% amonio peroksosulfato [(NH₄)₂S₂O₈] tirpalas; 9. Tetrametiledilendiaminas (TEMED); 10. Elektroforezės buferis (gaminimas: atsveriama 3,02 g TRIS, 14,4 g glicino, 1 g NDS ir pripilama H2O iki 1000 ml); 11. Standartinis mišinys baltymų, turinčių žinomas molekulines mases (,,markeris”); 12. Tiriamų baltymų pavyzdžiai ir gryno lizocimo tirpalas (koncentracija bus patikslinta laboratorinio darbo metu); 13. Izobutilo alkoholis, prisotintas vandens; 14. Baltymų tvirtinimo tirpalas;

Darbo eiga 1 diena

4 ml kiaušinio baltymo skiedžiama 40 ml buferio G. Viskas gerai išmaišoma magnetine maišykle ir centrifuguojama 10000×g 10 min. Prieš centrifugavimą mėgintuvėliai pasveriami. 0,5 ml supernatanto atidedama baltymų elektroforezei. Likęs supernatantas perpilamas į atskirą mėgintuvėlį. Į supernatantą dedama 1,5 g CM celiuliozės ir 15 min maišoma magnetine maišykle.

Mėginys centrifuguojamas 5000×g 5 min. 0,5 ml supernatanto atidedama baltymų elektroforezei. Nuosėdos užpilamos nedideliu kiekiu buferio G. Išmaišius viskas supilama į chromatografinę kolonėlę. Kolonėlė plaunama buferiu G. Matuojama plovimo frakcijų sugertis, esant 280 nm bangos ilgiui. Plovimas stabdomas, kai eliuate nebedektuojami baltymai (A280≤0,06). Per kolonėlę leidžiamas buferis G su 0,5 M NaCl. Renkamos frakcijos po 2 ml. Matuojama frakcijų sugertis, esant 280 nm bangos ilgiui. 0,5 ml didžiausią baltymo koncentraciją turinčios frakcijos atidedama baltymų elektroforezei. Elektroforezei skirtų frakcijų (2, 5, 7 žingsniai) koncentracija nustatoma Bredfordo metodu.

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!