Nukleorūgščių nustatymo kiekybiniai metodai

Nustatyti bendrą nukleorūgščių (NR) kiekį Escherichia coli ląstelių biomasėje ir DNR bei RNR kiekį tirpaluose.
E. coli ląstelių biomasė, DNR ir RNR tirpalai.
Automatinės 20 μL, 200 μL, 1000 μL, 5000 μL pipetės, spektrofotometras SF26, centrifuga K24 svarstyklės, vandens vonia.
Bendrojo NR kiekio nustatymas
Kiekybinio nustatymo metodai pagrįsti į NR sudėtį įeinančių heterociklinių bazių geba absorbuoti šviesą ultravioletinėje spektro dalyje. Tam būtina NR ekstrahuoti iš biologinio objekto ir jas hidrolizuoti iki mononukleotidų. Vienas iš spektrofotometrinių NR nustatymo metodų, pasiūlytas A. Spirino, grindžiamas nukleorūgščių ekstrakcija iš biologinio objekto karšta perchlorato rūgštimi ir tolesniu ekstrakto absorbcijos nustatymu ultravioletinėje spektro dalyje, esant bangos ilgiams 270 nm ir 290 nm. NR kiekis apskaičiuojamas pagal A. Spirino pasiūlytą formulę.
Tirpalai:
0,2 M HClO4 tirpalas, 500 mL;
0,5 M HClO4 tirpalas, 500 mL.
500 mg E. coli biomasės patalpinama į centrifuginį mėgintuvėlį ir užpilama 10 mL atšaldytos 0,2 M perchlorato rūgšties. Mėgintuvėlio turinys kruopščiai sumaišomas ir centrifuguojama 5 min. 10000 × g greičiu 0 °C temperatūroje. Šio proceso metu iš audinio pašalinami rūgštyje tirpūs laisvieji nukleotidai. Centrifuguotos nuosėdos suspenduojamos 10 mL 0,5 M HClO4, perkeliamos į stiklinį mėgintuvėlį, užkemšama kamščiu su įstatytu stikliniu vamzdeliu, šaldomu oro, ir 30 min. kaitinamos verdančio vandens vonioje. NR visiškai ekstrahuojamos iš ląstelių ir hidrolizuojamos. Susidaro rūgštyse tirpūs produktai.
Hidrolizatas atšaldomas, centrifuguojamas (10 min. 10000 × g), nupilamas iki nuosėdų, skiedžiamas 200 ir 500 kartų 0,5 M HClO4 ir matuojama spekrofotometru šviesos absorbcija, esant bangos ilgiams 270 nm ir 290 nm. Kaip kontrolinis tirpalas naudojama 0,5 M HClO4. Pagal formulę apskaičiuojamas 1 mL NR tirpale esantis fosforo kiekis:
CμgP =D270 - D290
0, 19
0,19 – perskaičiavimo koeficientas, atitinkantis 1 μg NR fosforo, 1 mL tirpalo.
Norint apskaičiuoti NR kiekį, reikia fosforo kiekį padauginti iš koeficiento 10,3 ir praskiedimo kartų.
CμgNR = CμgP *10,3 * praskiedimo kartai.
Gauname NR kiekį μg/mL.
Praskiesto NR tirpalo šviesos absorbcija matuojama dar kartą, esant bangos ilgiui 260 nm. Optinis tankis turi...

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!