Fermentinių kinetinių konstantų nustatymas

Naudojantis atlikto eksperimento duomenimis, išmokti apskaičiuoti dalyvaujančių medžiagų koncentraciją, fermentinės reakcijos greitį ir fermento kinetines konstantas. Įvertinti rankiniu būdu ir kompiuteriu gautus rezultatus tikslumo požiūriu.
Spektrofotometras UV-VIS su saviraščiu. Esant 340 nm bangos ilgiui stebimas NADH susidarymo greitis.
Mielių homogenizatas buvo frakcionuojamas ir buvo surinkta frakcija, turinti ADH aktyvumą. Chromatografiniais metodais parodyta, kad ši frakcija susideda iš homogeniško baltymo, kurio molekulinė masė 141 000 Da. Fotometriniu metodu (esant 280 nm bangos ilgiui) nustatyta baltymo koncentracija frakcijoje 12 mg/ml. Manoma, kad tai ADH.
Paruošiami darbui reikalingi tirpalai:
• 0,1 mol/l fosfatinis buferis, pH = 7,0;
• NADH tirpalas matavimo sistemos gradavimui. Tam 91,37 mg NADH (M = 709,4 g/mol) ištirpinama 1 ml buferio;
• 1 mol/l NAD+ tirpalas buferyje;
• 0,5 mol/l etilo alkoholio tirpalas buferyje (substratas).
Prieš nustatant fermento aktyvumą reikia sugraduoti matavimo sistemą. Tam į fotometro kiuvetė įpilama 1,8 ml buferinio tirpalo ir užfiksuojama saviraščio plunksnos padėtis („0“). Tada į fotometro kiuvetę įpilama 0,2 ml NADH tirpalo ir užfiksuojama nauja saviraščio plunksnos padėtis.
ADH aktyvumas buvo matuotas taip:
Į fotometro kiuvetę supilama:
• 1 290 µl buferio;
• 500 µl alkoholio tirpalo;
• 200 µl NAD tirpalo.
Įjungiamas saviraštis ir užfiksuojama pradinė plunksnos padėtis. Įsitikinama, kad plunksnos atsilenkimo laikui bėgant nėra (nėra jokių pašalinių reakcijų, kurios keistų šviesos sugertį kiuvetėje).
Tada į kiuvetę įpilama 10 µl fermento ir tirpalas greitai išmaišomas. Registruojamas sugerties didėjimas fotometro kiuvetėje (2–4 min.). Kalibravimo ir aktyvumo matavimo vaizdas yra 1 pav.
1 užduotis
ADH aktyvumo nustatymas.
Apskaičiuojama kiek µmol NADH yra 1 ml tirpalo, matavimo sistemos gradavimui:
1*106 µmol atitinka 709,4 g NADH
x µmol – 0,09137 g NADH
x=0,09137g*1*106µmol/709,4g=128,8µmol
Tirpale yra 128,8µmol NADH.
Apskaičiuojama koks kiekis µmol NADH yra 0,2 ml tirpalo:
1 ml tirpalo yra 128,8 µmol NADH
0,2 ml – x µmol NADH
x=0,2ml*128,8µmol/1ml=25,76µmol
0,2 ml tirpalo yra 25,76µmol NADH.
Apskaičiuojama saviraščio padalos (1mm) vertė µmol NADH (audojantis pav.1 vaizdu):
55 mm atitinka 25,76µmol NADH
1 mm – x µmol NADH
x=1mm*25,76µmol/55mm=0,468 µmol
Saviraščio padalos vertė yra 0,468 µmol/min.
Apskaičiuojama NAD koncentracija fotometro kiuvetėje:
200...

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!