Saldiklių nustatymas vaisvandeniuose kapiliarine zonų elektroforeze

 Darbe pateikti kapiliarinės zonų elektroforezės (KZE) metodo optimizavimo būdai ir nurodyti įteisinimo žingsniai dirbtinių saldiklių vaisvandeniuose kiekybinei analizei. Optimalus skirstymas gautas naudojant 50 mM karbonatinį buferį (pH 9,5). Geriausia skiriamoji geba ir didžiausias efektyvumas pasiekti taikant 25 kV įtampą esant 20 °C temperatūrai. Analizės metu taikyta hidrodinaminė injekcija. Aspartamo, sacharino ir acesulfamo detekcija atlikta esant 220 nm bangos ilgiui. Aptarti reikalingi metodui įteisinti žingsniai, t. y. atrankumas, tikslumas ir glaudumas, aptikimo ir nustatymo ribos, linijiškumas. Nustatytos aptikimo ribos saldikliams taikant KZE metodą: 0,07 mg/ml aspartamui, 0,006 mg/ml sacharinui ir 0,01 mg/ml acesulfamui. Įvadas Saldikliai yra medžiagos, suteikiančios maistui saldų skonį, jie kelis šimtus kartų saldesni už cukrų, nekaloringi bei gerokai pigesni, tad jie paklausūs tarp gamintojų. Pvz.: aspartamas(E 951) - saldesnis už cukrų 180 kartų, sacharinas(E 954) - 500 kartų, acesulfamas K(E 950) - 150-200 kartų. Gėrimus su saldikliais lengva gaminti, ir tokių produktų savikaina maža. Jų kiekis produkte turi atitikti nustatytas leistinas koncentracijas ir užtikrinti vartotojų sveikatos saugumą. Kai kuriose šalyse tam tikrų saldiklių vartojimas yra uždraustas, nes jie pripažįstami kaip kancerogeninės ar neurogeninės medžiagos. Išskirtinos dvi nuomonės apie saldiklių vartojimą: pagal vieną – saldikliai nekenksmingi žmonių sveikatai, o pagal kitą priešingai – norima uždrausti kai kurių saldiklių vartojimą gamyboje. Lietuvos higienos normos HN 53:2003 „Leidžiami vartoti maisto priedai“ sąraše pateikta 11 saldiklių, iš kurių dažniausi aspartamas, sacharinas bei acesulfamas-K . Tai dirbtiniai saldikliai, kurie organizme nevirškinami, todėl visiškai nekaloringi, išskyrus aspartamą, kurio kaloringumas – 4 kcal/g. Pagal Europos Parlamento ir Europos Tarybos direktyvą 94/35/EB „Dėl maisto produktuose naudojamų saldiklių“, saldiklių vartojimas maisto produktuose yra reglamentuotas. Cukrų pakeisti saldikliais leidžiama (I) gaminant mažos energetinės vertės maistą; (II) gaminant nesukeliančius karieso maisto produktus arba maistą be cukraus priedų; (III) siekiant pailginti maisto produktų galiojimo laiką ir (IV) gaminant dietinius produktus. Dirbtiniai saldikliai labiausiai paplitę gėrimų gamyboje. Saldiklių kiekis yra ribojamas, todėl būtina atlikti tyrimus jiems identifikuoti bei kiekiui nustatyti įvairiuose maisto produktuose. Saldikliams nustatyti maisto produktuose taikomas junginių skirstymo metodas, toks kaip kapiliarinė elektroforezė (KE). Universali ir nesudėtinga, dažniausiai naudojama KE rūšis yra kapiliarinė zonų elektroforezė (KZE), kur atskyrimo mechanizmas pagrįstas krūvio ir masės santykio skirtumais. Tai efektyvus, greitas, mažatūris, automatizuotas bei pigus analizės metodas. Šiuo metodu, kaip ir kitais KE metodais, suskirstomi ne tik saldikliai, bet ir konservantai, dažikliai. Darbo tikslas – optimizuoti ir atlikti dirbtinių saldiklių (aspartamo, sacharino ir acesulfamo) kokybinę ir kiekybinę analizę vaisvandeniuose kapiliarinės zonų elektroforezės metodu. Tyrimų metodai Kapiliarinė elektroforezė atlikta taikant Hewlett-Packard HP3D KE sistemą su oro konvekcine kapiliaro aušinimo sistema ir diodų matricos detektoriumi bei HP3D CE ChemStation programine įranga sistemos kontrolei, duomenų rinkimui ir jų analizavimui. Naudojamas 50 μm vidinio skersmens lydaus silikagelio kapiliaras. Prieš pradedant taikyti metodą, kapiliaras kondicionuojamas praplaunant 1,0 mM NaOH (30 min), 0,1 mM NaOH (20 min) ir distiliuotu vandeniu (15 min). Prieš kiekvieną analizę kapiliaras plaunamas 0,1 mM NaOH (1 min), distiliuotu vandeniu (1 min) ir 2 min darbiniu buferiu, kad kapiliaro paviršius visiškai ir tolygiai būtų padengtas silanolinėmis grupėmis. 5 mg/ml etaloniniai tirpalai ruošiami distiliuotame vandenyje, kuris filtruotas per 0,2 μm porų filtrą. Visi standartų, mėginių tirpalai ir buferiai filtruojami, naudojant 0,2 μm porų membraninius filtrus. Realūs mėginiai injektuojami tiesiogiai, jų neskiedžiant. CO2 iš vaisvandenių pašalinamas ultragarsu. Analizei naudojamas karbonatinis buferis (pH 9,5). Reikiamas pH pasiekiamas 1 mM NaOH tirpalu. Paruoštas buferis degazuojamas vakuumu. Naudotos medžiagos: aspartamas, acesulfamas ir sacharinas, kurių grynumas ≥99 %; natrio karbonatas chemiškai grynas; natrio hidrokarbonatas chemiškai; acetonitrilas chromatografinio grynumo; metanolis chromatografinio grynumo; NaOH chemiškai grynas. Tyrimui pasirinkti gėrimai buvo pirkti prekybos centruose. Tirti devyni vaisvandeniai, kurių penki gaminti Lietuvoje (I–V), trys – Lenkijoje (VI–VIII) ir vienas – Estijoje (IX). IV ir IX gėrimai buvo be saldiklių (gamintojo nuoroda). Rezultatai ir jų aptarimas Saldiklių analizei KZE pasirinktas šarminio pH karbonatinis buferis.Darbo metu buvo siekiama optimizuoti sąlygas taikant šį metodą tik saldiklių analizei. Skirstymo optimizavimo metu buvo keičiama buferio joninė jėga (20 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM) bei buferio pH (9; 9,5; 10). Papildomas dėmesys skirtas aspartamo analizei KZE metodu, nes susidurta su sunkumais atskiriant šį saldiklį. Siekiant elektrosuspaudimo ir didesnio atskyrimo efektyvumo, etaloninis aspartamo tirpalas buvo skiedžiamas skirtingais tirpikliais: vandeniu, 50 mM bei 5 mM karbonatiniu buferiu. Efektyvumo ir rezultatų pakartojamumo duomenys pateikti 1 lentelėje. 1 lentelė. Aspartamo smailės efektyvumas ir rezultatų pakartojamumas Tirpiklis Chromatografiniai parametrai** tm, min (SSN, proc.) N, m-1 50 mM karbonatinis buferis 8,8 (5,2) 115 700 5 mM karbonatinis buferis 21,3 (12,6) 24 400 Vanduo 19,2 (4,6) 28 500 Maksimalus efektyvumas gaunamas, kai aspartamas tirpinamas 50 mM karbonatiniame buferyje, todėl analizės metu naudojami saldiklių etalonų mišiniai gaminami vandeninius jų tirpalus skiedžiant 50 mM karbonatiniu buferiu iki reikiamos koncentracijos. Taip pat bandyta naudoti organinių tirpiklių priedus darbiniame buferyje: 10 % metanolio, 10 % acetonitrilo. Organiniai priedai padidina analizės trukmę, nes sumažina elektroosmozę. Ilgiausiai analizė truko, kai buvo naudojamas metanolis, o trumpiausiai – kai naudojamas buferis be priedų. Mažiausias efektyvumas buvo gautas naudojant acetonitrilo priedą. Todėl optimaliai analizei pasirinktas karbonatinis buferis be organinių tirpiklių priedų. Kitas metodo optimizavimui pasirinktas parametras buvo įtampa. Elektroforezinis judris priklauso nuo elektros lauko stiprio. Tiek elektroosmozė, tiek elektroforezė tiesiogiai proporcingi elektros lauko stipriui. Tikslinga naudoti kuo didesnį elektros lauką, nes nuo jo priklauso analizės trukmė, skirstymo efektyvumas bei skiriamoji geba. Įtampos kėlimą riboja išsiskirianti Džaulio šiluma. Optimali įtampa nustatoma palaipsniui ją didinant, kol pastebimas skiriamosios gebos (Rs) pablogėjimas. Įtampa buvo vertinta 20–30 kV intervalu. Tirtos analitės gerai ir efektyviai atskiriamos ir esant 30 kV įtampai. Migracijos trukmė, vadinasi ir analizės trukmė, yra trumpiausia esant didžiausiai įtampai. Atsižvelgiant į tai, kad tiriant realius mėginius skiriasi mėginio terpė ir skiriamoji geba, pasirinkta 25 kV įtampa, kuriai esant skiriamoji geba (Rs) yra didesnė negu esant 30 kV įtampai. Esant 25 kV įtampai saldiklių migracijos trukmės SSN yra: aspartamui 1,7 %, sacharinui 2,0 %, acesulfamui 2,2 % nuo vidutinės reikšmės. Tirta temperatūros įtaka saldiklių skirstymui. Žinoma, kad mažėjant temperatūrai, analičių migracijos trukmė ilgėja, nes dėl klampos padidėjimo mažėja elektroosmozinis ir elektroforezinis judriai. Kita vertus, aukštesnėje temperatūroje iškyla burbulų susidarymo kapiliare pavojus ir analizės pakartojamumas sumažėja. Tai patvirtina ir mūsų gauti duomenys. Lyginant rezultatus, didžiausias efektyvumas, kai temperatūra 15 ir 20 °C. Migracijos trukmės SSN abiem atvejais yra mažiau 1 % (2 lentelė). Atsižvelgiant į analizės trukmę ir rezultatų pakartojamumą, pasirinkta 20 °C temperatūra. Tirta kapiliaro ilgio įtaka analizės trukmei. Analizės metu buvo naudojami skirtingo ilgio kapiliarai. 3 lentelėje pateikti duomenys, gauti atliekant analizę vienodomis sąlygomis naudojant skirtingo ilgio kapiliarus. Naudojant trumpesnį kapiliarą gautas pakankamai didelis atskyrimo efektyvumas ir gerokai trumpesnė analizės trukmė. Todėl tolimesnei analizei pasirinktas 44 cm ilgio kapiliaras. Įvertinus metodo optimizavimui tirtų parametrų įtaką, nustatytas optimalus saldiklių skirstymo režimas: 50 mM karbonatinis buferis (pH 9,5); 44 cm ilgio kapiliaras (35,5 cm iki detekcijos lango); injekcija 250 mbar⋅s; įtampa 25 kV; temperatūra 20 °C; UV detekcija ties 220 nm. Šiomis sąlygomis atlikta saldiklių standartų mišinio analizės įprastinė elektroferograma ir spektrinius duomenis atspindinti erdvinė elektroferograma (1 pav.). 2 lentelė. Temperatūros įtaka analičių migracijos trukmei ir smailių plotui Temperatūra, °C tm, min (SSN, proc.) S/tm*, mAU/min (SSN, proc.) aspartamas sacharinas acesulfamas aspartamas sacharinas acesulfamas 15 8,2 (0,4) 13,1 (0,6) 15,4 (2,7) 21 (10,2) 32 (1,8) 15 (8,9) 20 7,5 (0,6) 12,0 (0,9) 13,8 (0,8) 21 (4,1) 36 (2,2) 17 (1,9) 25 6,8 (1,7) 10,9 (2,4) 12,0 (2,1) 25 (3,2) 44 (5,1) 22 (10,2) 30 6,2 (2,6) 9,4 (4,0) 10,7 (4,6) 26 (1,5) 40 (0,4) 23 (3,4) 35 5,4 (1,5) 7,9 (3,1) 8,9 (3,2) 28 (5,8) 50 (0,9) 24 (2,4) 3 lentelė. Duomenys, gauti naudojant skirtingo ilgio kapiliarus Kapiliaro ilgis 71 cm 59 cm 44 cm tm, min (SSN, proc.) N, m-1 tm, min (SSN, proc.) N, m-1 tm, min (SSN, proc.) N, m-1 Aspartamas 11,6 (1,6) 23400 6,9 (1,8) 24800 5,5 (0,2) 25500 Sacharinas 20 (3,5) 35200 10,9 (2,2) 33500 8,3 (0,3) 29800 Acesulfamas 23,8 (4,1) 38700 12,4 (2,3) 43400 9,2 (0,2) 49800 Iš erdvinės elektroferogramos matyti, kad saldiklių detekcijai pasirinktas 220 nm bangos ilgis yra tinkamiausias, nes atskirų saldiklių absorbcijos maksimumai nesutampa. Atlikti metodo įteisinimo žingsniai. Smailių grynumas, kartu ir metodo atrankumas, įvertintas analizuojant smailių UV spektrus. Smailių grynumas paprastai nustatomas užrašant ir palyginant spektrus skirtingose smailės vietose. Kad saldiklių smailės yra pakankamai grynos, buvo nuspręsta iš to, kad skirtingose smailės vietose užrašyti spektrai sutapo. Nustatytas smailių grynumas aspartamui – 89 %, sacharinui – 95 %, acesulfamui – 92 %. Saldiklių smailėms identifikuoti gėrimuose taikytas priedo metodas (2 pav.). Kiekybiniam saldiklių įvertinimui sudaryti etaloninių tirpalų gradavimo grafikai. Linijinis intervalas įvertintas naudojant saldiklių etaloninių tirpalų koncentracijas iki 5 mg/ml. Tiesinės regresijos lygčių duomenys pateikti 4 lentelėje. Kiekviena koncentracija pakartotinai matuota (n), ir įvertintos paklaidos. Tiesiškumui įvertinti apskaičiuojamas koreliacijos koeficientas (R2). Skirtingų saldiklių aptikimo ir nustatymo ribos apskaičiuotos pasirinkus, jog signalas viršija triukšmo lygį 3 ir 10 kartų atitinkamai (5 lentelė). Saldikliai Regresijos koeficientas Lygties laisvasis narys R2 n Aspartamas 25 -0,05 0,994 5 Sacharinas 324 -1,21 0,989 8 Acesulfamas 135 -2,51 0,993 5 4 lentelė. Saldiklių gradavimo grafikų duomenys 5 lentelė. Saldiklių aptikimo ir nustatymo ribos nustatytos optimizuotu kapiliarinės elektroforezės metodu Saldiklis Aptikimo riba, mg/ml Nustatymo riba, mg/ml Aspartamas 0,024 0,070 Sacharinas 0,002 0,006 Acesulfamas-K 0,004 0,013 Nealkoholiniuose gėrimuose leidžiamos vartoti maisto saldiklių koncentracijos: acesulfamo-K – 350 mg/l, aspartamo – 600 mg/l, sacharinui – 80 mg/l (gazuotiems gėrimams 100 mg/l). Išanalizavę prekybos centruose įsigytus vaisvandenius nustatėme (6 lentelė), kad saldiklių koncentracija visuose tirtuose vaisvandeniuose buvo mažesnė už leistiną vartoti koncentraciją. Tuose vaisvandeniuose, kur gamintojo buvo nurodyta, kad sudėtyje saldiklių nėra, saldiklių nenustatėme (VIII ir IX mėginiai). Kai kurie gamintojai ant vaisvandenių etikečių nurodo sudėtyje esančių saldiklių koncentraciją, tačiau ji ne visais atvejais sutapo su nustatyta: kartais nustatyta saldiklių koncentracija buvo mažesnė negu užrašyta (pvz., aseculfamo-K IV gėrime), o kartais didesnė (pvz., acesulfamo-K III gėrime). Matyt, gamintojai griežtai nekontroliuoja saldiklių koncentracijos galutiniame produkte, nes leistina riba kai kuriems saldikliams yra beveik dešimt kartų didesnė negu naudojama, išskyrus sachariną, kurio nustatytas kiekis (0,071 mg/ml) artimas leistinam (0,08 mg/ml). 6 lentelė. Saldiklių kiekis gėrimuose, nustatytas KZE metodu (skliaustuose pateiktas gamintojų deklaruotas kiekis) Gėrimas Aspartamas, mg/ml Sacharinas, mg/ml Acesulfamas, mg/ml I - 0,029 0,083 II 0,302 - 0,090 III

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!