Embrionų gavimas iš pieninių ir mėsinių galvijų

Embrionų gavimas iš pieninių ir mėsinių galvijų • Pasaulinė embrionų pramonė (apžvalga) • Kodėl reikalingos naujovės reprodukcijoje • Donorių charakteristika • Kaip paruošti donorę • Embrionų plovimo procesas • Embrionų vertinimas • Embrionų įsodinimo būdai ir galimi rezultatai Turinys Pasaulinė galvijų embrionų produkcija = 1.6 M (IETS Statistics 2017) Galvijų embrionų persodinimas = 950’000 (IETS Statistics 2017) JAV galvijų embrionų persodinimo industrija (JAV + Kanada užima 60% embrionų gavybos pasaulyje) 0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 Embrionų gavyba JAV OPUs MOET Stabili gavyba Bulių spermos gavybos centrai ir “Genetikos lenktynės” 40908 107949 0 20000 40000 60000 80000 100000 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015 2016 2017 OPUs MOET 2017 didelis padidėjimas JAV galvijų embrionų persodinimo industrija Super-ovuliacija/ET (2017) Europa + Rusija 1160 6729 3412 2500 2493 1855 551 61 22316 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 22000 24000 BELGIUM FRANCE GERMANY ITALY NETHERLANDS RUSSIAN FEDERATION SPAIN UK TOTAL Superovulation Collections Embrionų persodinimas 2017 metais - 180’000 embrionų persodinta SINCHRONIZUOTOMS karvėms ar telyčioms!! Embrionų persodinimas (2017) Europa + Rusija • Turi būti: o Nuolatinis ir kaupiamasis, ekonomiškas ir tvarus • Genetinio potencialo didėjimas priklauso nuo: o Atrankos intensyvumo o Tikslumo o Genetinės įvairovės o Kryptingo galvijų kartų gerinimo skaičiaus Genetinio potencialo didinimas • >150,000 kiaušialąsčių gimimo metu • Tik 1 kiaušialąstė ovuliuojama per ciklą – 17 ciklų per metus • Vidutiniškai karvė atveda 50 D au gy b in ės o vu lia ci jo s (% ) Pieno produkcija (Kg/d) DO = 3.6% (10/274) Telyčių grupėje Lopez et al., J. Dairy Sci. 88:2783; 2005 Karvių lytinio ciklo statuso įtaka embrioniniam mirtingumui po sėklinimo Embrioninis mirtingumas tarp 38 ir 66 parų po sėklinimo Karvių lytinio ciklo statusas Neovuliuojančios n=334 (30,8 %) Turinčios ciklą n=750 (69,2 %) P - vertė Embrioninis mirtingumas 19.7 % 6.8 % 0.02 Žemas-P4 Aukštas-P4 P - vertė Veršingos 29 parą 37.1% (101/272) 51.0% (149/292) 0.001 Veršingos 57 parą 31.2% (84/269) 47.2% (137/290) 0.001 Embrioninis mirtingumas 14.3% (14/98) 6.8% (10/147) 0.05 Karvių lytinio ciklo statuso įtaka apsivaisinimui po sėklinimo (n=564) Cunha et al., 2008; ABSTR J Dairy Sci Karvių lytinio ciklo statuso įtaka apsivaisinimui ir embrioniniam mirtingumui po pirmo sėklinimo 31% 16% 52% 6% 0 10 20 30 40 50 60 70 P/AI (61 d) Loss (33-61 d) P/ A I ( % ) Anovular Cycling n=106 n=274 Sterry et al., 2006; J Dairy Sci 89:4237 ** Kaip sukelti super-ovuliaciją karvei donorei • Norint pradėti gydymą hormoniniais preparatais, svarbu žinoti kada paskutinį kartą karvei įvyko ovuliacija (galime natūraliai stebėti karvę arba sukelti ovuliaciją hormoninių preparatų pagalba) • 8,5 -10,5 paros po ovuliacijos – geriausias laikas pradėti super-ovuliacijos protokolą Progesteronas 10Ovulation 21 Fo lli cu la r Si ze Parinkimas Atranka Dominavimas Atrezija Ovuliacija Dvi folikulinės bangos Priklauso nuo FSH Priklauso nuo LH Day After Ovulation Siekiant gerų rezultatų: 1. Gydymas FSH preparatais turi būti pradėtas folikulinės bangos pradžioje, nes tik tokiu atveju bus užtikrinta, kad daugiau nei vienas folikulas galės bręsti toliau; 2. Tai pat labai svarbu, aukšta hormono progesterono koncentracija, tai padeda išvengti priešlaikinių ovuliacijų Kodėl lytinio ciklo sinchronizacija svarbi? Karvių donorių atranka Antrinių folikulų skaičiavimas, folikulai ≥ 3mm Tai metodas įvertinti kiek folikulų yra parenkama į folikulinę bangą 1. Labai skiriasi tarp skirtingų karvių (Burns et al., 2005) 2. Tai pasikartojantis procesas visą karvės gyvenimą (Burns et al., 2005) Folikulų (≥3 mm) skaičius kiaušidėse 2 paros po folikulinės bangos pradžios arba apie 4,6 paros po įvykusios ovuliacijos (duomenys iš 306 pieninių karvių) (Mossa et al., 2012). Geros donorės Prastos donorės Antralinių folikulų skaičius atspindi kiaušidžių rezerve esančių ovocitų kiekį Mažai ≤ 15 Folikulai ≥ 3mm * Banga Daug ≥ 25 Folikulai ≥ 3mm * Banga (Ireland et al., 2008) Morfologiškai sveikų folikulų skaičius kiaušidėse priklausomai nuo antrinių folikulų skaičiaus folikulinėse bangose. Galvijų kiaušialąsčių ir folikulų vystymasis (Scaramuzzi et al., 2011) 93 paros (Reviewed by Fair et al., 2003) Genetinis potencialas, kuris reguliariai yra prarandamas Kokie preparatai naudojami? • Gamina kumelingos kumelės, apie 40-130 parą, didžiausi kiekiai išskiriami 50-80 parą • Kitoms rūšims stimuliuoja FSH ir LH aktyvumą • Ilgas pusinės eliminacijos laikas (≈ 40 val.) • 10 parą po ovuliacijos - vienkartinė injekcija 1500-3000 TV (2500) ir po 2 parų PgF2α eCG/PMSG • Stimuliuoja folikulų augimą netgi įvykus ovuliacijai (kitų folikulų) • Dideli neovuliuojantys folikulai • Aukšta E2 konc. 2 – 6 parą sekančiame lytiniame cikle • Prasta embrionų kokybė • Sunku įsigyti eCG/PMSG Trūkumai � Ankstyvas embriono vystymasis gimdoje (Spencer et al., 2004) Flushing Hipofizės ekstraktai • Trumpas pusinės eliminacijos laikas (~5 val.) – gydymui reikia keleto injekcijų • 32 mg karvėms /24 mg telyčioms, esant lytinio ciklo viduriui • FSH geriau negu PMSG, bet daug brangesnis Geriausias laikas pradėti folikulų augimo stimuliaciją: • Yra nustatyta, kad atsakas į gydymą bus geriausias, jeigu preparatai bus pradėti naudoti naujos folikulų bangos pradžios metu. Laikas kada prasideda nauja folikulų banga labai priklauso nuo karvės, turi 2 ar 3 folikulines bangas. Geriausias laikas pradėti folikulų augimo stimuliaciją: • Geriausias laikas 8,5 – 10,5 paros po buvusios ovuliacijos • Pradėjus hormoninį gydymą vis dar esant dominuojančiam folikului, atsakas į hormoninį gydymą sumažėja 40 – 50 %. Geriausias laikas pradėti folikulų augimo stimuliaciją: • Kiaušidėse esant dideliam skaičiui 3 – 6 mm dydžio folikulų, 8 – 10 parą po įvykusios ovuliacijos ir esant 1 dideliam folikului (> 10 mm) • Tai rodo, kad dominuojantis folikulas nyksta ir prasideda naujos folikulų bangos augimas – Puikus metas pradėti gydymą Geriausias laikas pradėti folikulų augimo stimuliaciją: • Super-ovuliacijos gydymą pradėti lytinio ciklo viduryje vis dar populiaru • Pagrindiniai trūkumai: • “Ne visos karvės turi vienodą lytinį ciklą” (G. Orwell 1945) • Būtina kasdien stebėti karvę, kad nustatyti ovuliaciją ir gydymui tinkamiausią laiką • Neįmanoma vienu metu pradėti gydymą grupei gyvulių Kaip sukelti poli-ovuliaciją? Kaip sukelti poli-ovuliaciją? (Hafez and Hafez 2000) Laiko intervalas nuo pirmos iki paskutinės ovuliacijos Tyrimo metodika: 1. 11 pieninių telyčių ir 14 pieninių karvių 2. Gydymas FSH pradėtas po natūralios rujos arba PgF2α 3. FSH gydymas pradėtas praėjus 9 – 10 parų po rujos Laiko intervalas nuo pirmos iki paskutinės ovuliacijos Tyrimo metodika FSH PgF2� 9 12 60 h 72 h AI AI (Purwantara et al., 1994) FSH PgF2� 9 12 Rujos požymiai 4h Pirma Paskutinė Ovuliacijos Laiko intervalas nuo pirmos iki paskutinės ovuliacijos Tyrimo metodika (Purwantara et al., 1994) • Vidutinis laiko tarpas nuo PgF2α injekcijos iki pirmos ovuliacijos • 68.6 ± 1.3 (intervalas 60 – 84 val.) • Vidutinis laiko tarpas nuo PgF2α injekcijos iki paskutinės ovuliacijos • 77.0 ± 1.3 (intervalas 60 – 84 val.) • Vidutiniškai visos ovuliacijos įvyko per 8.3h ± 0.5 • 60% ovuliacijų įvyko per pirmas 4 val. Laiko intervalas nuo pirmos iki paskutinės ovuliacijos: Rezultatai (Purwantara et al., 1994) Alternatyvos, jeigu nežinome karvės lytinio ciklo • Kiaušidėse visi folikulai > 5 mm yra išsiurbiami naudojant specialų prietaisą, kuris yra naudojamas išsiurbti folikulus OPU procedūroje, • Ši procedūra pašalina slopinantį hormonų (E2 ir Inhibinas) poveikį, • Nauja folikulų banga prasideda praėjus 1 parai, (Bergefeld et al., 1997, Barcalado et al., 1999) Folikulų abliacija Alternatyvos, jeigu nežinome karvės lytinio ciklo Folikulų abliacija • Gydymas FSH pradedamas praėjus 2 paroms po folikulų abliacijos, • Rekomenduojamas papildomas gydymas progesteronu, • Rekomenduojam, Embrionų plovimas Alternatyva: Norint karvei pradėti naują folikulinę bangą galima panaudoti GnRH preparatus • GnRH priverčia ovuliuoti dominuojantį folikulą ir per 1,5 paros prasideda nauja folikulinė banga, • Jeigu neįvyks dominuojančio folikulo ovuliacija, tada tikėtini prasti super- ovuliacijos rezultatai (Deyo et. al., 2001) 1. Vieno plovimo metu surenkama 6.7 gyvybingo embriono (IETS Statistics 2016) 2. Vieno plovimo metu išplaunama - 10 – 12 struktūrų, įprasta sperma - 65% tinkami persodinimui; seksuota sperma - 40-60% tinkami persodinimui, 2013 vidutiniškai buvo gaunama - 25% (Mikkola et al., 2017) Embrionų plovimo rezultatai: Dairy EU (IETS 2013) Vidutiniškai išplaunama embrionų Embrionų plovimo technika • 7 para po sėklinimo ✓ Anksčiau: prastas „prigijimas“ ✓ Vėliau: sunku identifikuoti • 2 - išėjimų, 3 - išėjimų kateteriai ✓ 30-60 ml ✓ Plovimo skystis 500-1000 ml • Fiksavimo staklės • Embrionų paieškai skirtos priemonės • Stereo mikroskopas • Embriono užšaldymo įranga Įranga: Kaklelio praplėtėjas: • 7 lytinio ciklo dieną, esant aukštai progesterono koncentracijai gimdos kaklelis yra uždaras, • Vyresnėms karvėms, gali būti praviras • Bet kokiu atveju patariama naudoti praplėtėją, nes kaklelyje yra tirštų gleivių kurios gali užkišti kateterį • Tai pat gleivės apsunkina išplautų embrionų paiešką, Įranga: Įranga: 65-70 cm Stiletas Embrionų plovimas Kateterio padėtis Atskirai praplaunamas kiekvienas gimdos ragas (karvėms 1000 ml tirpalo, telyčioms 500 ml). Plovimas atliekamas įleidžiant tirpalą nedideliais kiekiais ir po to jį išsiurbiant, svarbu, kad išsiurbti embrionai būtų laikomi reikiamoje temperatūroje. Embrionų plovimas Po kiekvieno skysčio sušvirkštimo atliekamas švelnus gimdos masažas, kad embrionai lengviau išsiplautų Pradedantiesiems rekomenduojama naudoti atvirą metodą, kad būtų galima įvertinti skysčio netekimą Skysčio praradimas = tikėtinas embrionų praradimas!! Nepakankamas fiksavimas Per mažai skysčio Nepakankama manipuliacija Embrionų surinkimas plovimo metu Filtro tankumas - 65-75 µm, Kiaušialąstė - 120 µm, Embrionas - 150-200 µm Išplauto turinio paruošimas Embrionų paieška Embrionų kokybės įvertinimas Stadijos • 1 Zigota (neįmanoma žinoti, ar perspektyvi ar ne) • 2 Skilimo stadija (2 ląstelės) iki 16 ląstelių stadijos • 3 Ankstyva morula • 4 Morula • 5 Ankstyva blastocista • 6 Blastocista • 7 Išsiplėtusi blastocista • 8 Subrendusi blastocista • 9 Besiplečianti subrendusi blastocista Embrionų kokybės įvertinimas Klasė ar kokybės kodas: • 1 Puikus/geras (85-100% gyvų ląstelių) • 2 Vidutinis (50-80% gyvų ląstelių) • 3 Prastas (25%-50% gyvų ląstelių) • 4 Degeneruotas/Negyvas International Embryo Transfer Society Manual 2010 edition Plovimo rezultatai: • 16 struktūrų ✓ 4 kompaktiškos morulos (tankios) ✓ 1 ankstyva blastocista ❖ 10 neapvaisintos kiaušialąstės ❖ 1 ankstyva morula Kur perkelti embrioną? Embriono perkėlimas Recipientės • Įvertinti sinchronizacijos efektyvumą • Kai atliekamas donorės sėklinimas, patikrinti recipientes • Embrionų perkėlimas - 6,5 – 7 paros po sėklinimo • Šaldytiems embrionams tolerancija ± 12 val. (skirtumas tarp donorės ir recipientės) • Šviežiems embrionams tolerancija ± 24 val. • Įvertinti ar recipientės turi gerą geltonąjį kūną • Recipientės geltonasis kūnas >15 mm • Patariama naudoti ultragarsinį prietaisą • Esant rujai patariama naudoti GnRH Kaip perkelti embrionus Vengti visų įmanomų stresinių situacijų: • Jeigu gyvulys nervingas, naudoti sedaciją • Reikia atlikti epidurinę nejautrą - 2% lidokainas (4-8 ml) • Apiplauti ir nusausinti vulvą • Labai svarbi įrankių dezinfekcija • Patariama naudoti vienkartines priemones (kombinezonas, pirštinės...) • Embrionas perkeliamas į paskutinį gimdos rago trečdalį, toje pusėje kur yra geltonasis kūnas Recipienčių sinchronizacija 5 Days PRID Delta® PgF D0 D8 D15 Embrionų sodinimasGnRH eCG D5 5 Days PRID Delta® GnRH PgF D0 D8 D15 Embrionų sodinimasGnRH eCG D5 PgF D6 (Bo et al., 2019) Rezultatai: Embrionų gavybos būdas ir prigijimas 0 10 20 30 40 50 60 Heifers Cows V e rš in gu m as (% ) Recipientės Fresh MOET Frozen MOET Fresh IVF Frozen IVF 34 47 37 42 57 41 33 29 (216) (683) (5203) (183) (651) (1042) (2225) (194) (Ferraz et al., 2016)

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!