DNR elektropernašos į ląsteles in vitro efektyvumo priklausomybė nuo laiko tarpo tarp aukštos ir žemos amplitudės elektrinių impulsų

SANTRUMPOS HV – aukštos amplitudės, trumpas elektrinis impulsas. LV – žemos amplitudės, ilgas elektrinis impulsas. GFP – žalias fluorescuojantis baltymas. EP – elektroporacija Šio tiriamojo darbo tikslas – naudojant aukštos amplitudės, trumpus (HV) ir žemos amplitudės, ilgus (LV) elektrinius impulsus, įvertinti DNR elektropernašos į Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles in vitro efektyvumo priklausomybę nuo laiko tarpo tarp 1HV ir 1LV impulsų. Vykdant DNR elektropernašą elektropernašos į Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles, buvo stengiamasi išskirti dvi elektrinio lauko poveikio funkcijas: membranų elektroporacijos, kurią sukelia aukštos įtampos, mažos trukmės (HV) elektrinis impulsas, ir DNR elektroforezės, kuri priklauso nuo žemos įtampos, ilgos trukmės (LV) impulso parametrų. Iškėlėme hipotezę, kad HV impulso poveikyje susiformavusios ląstelės membranos poros impulsui pasibaigus iškart ima mažėti, todėl tikimės, kad sumažinę laiko tarpą tarp 1HV ir 1LV impulsų, pasieksime didesnio DNR transfekcijos efektyvumo. Tyrimuose buvo naudojamos žalią fluorescencinį baltymą ir liuciferazę koduojančios plazmidės, kurių koncentracijos – 10, 50 ir 100 µg/ml. Pasirinkti tokie impulsų parametrai: 1HV – 1200 V/cm, 100 µs, 1LV – 100 V/cm, 100 ms. Pasirinktos laiko trukmės tarp 1HV ir 1LV impulsų – 1 µs, 10 µs, 100 µs, 1ms, 10 ms, 100 ms ir 1 s. Nustatėme, kad naudojant trumpesnius nei 1s laiko trukmės tarpus tarp 1HV ir 1LV elektrinių impulsų, didėja suminis DNR elektropernašos į CHO ląsteles efektyvumas bei transfekuotų ląstelių dalis, kuri apskaičiuojama nuo kiekvienoje eksperimentinėje grupėje išlikusių gyvybingų ląstelių, tačiau mažėja CHO ląstelių gyvybingumas. Naudojant skirtingas plazmidinės DNR koncentracijas nustatėme, kad didėjant DNR koncentracijai didėja pernešamos į CHO ląsteles DNR kiekis bei elektropernašos efektyvumas. SUMMARY The aim of this experimetal study was to evaluate dependence of DNA electrotransfer into Chinese hamster ovary cells in vitro on time gap between high amplitude, short duration (HV) and low amplitude, long duration (LV) electric pulses. We investigated the effectiveness of DNA electrotransfer into Chinese Hamster Ovary cells in vitro using two types of pulses and aimed to dissociate cell electroporation, induced by HV pulses, and DNA electrophoresis dependence on the parameters of LV pulses. Our hypothesis was based on the notion that soon after HV pulse pores are formed in cell membrane start to shrink. We expected to reach better efficiency of DNA electrotransfer by reducing time gap between 1HV and 1LV electric pulses. We used three GFP and luciferase encoding plasmids concentrations – 10, 50 and 100 µg/ml. The parameters of pulses were: HV – 1200 V/cm, 100 µs, LV – 100 V/cm, 100 ms. Time gap duration between pulses were – 1 µs, 10 µs, 100 µs, 1 ms, 10 ms, 100 ms and 1 s. Our results confirmed that DNA electrotransfer through a permeabilized membrane is dependent on time gap between short duration, high voltage (HV) and long duration, low voltage (LV) electric pulses and plasmid DNA concentration. We found that using shorter than 1 s duration of time gap between 1HV and 1LV pulses results in decrease in cell viability, but also results in increases of total DNA transfection efficiency and percentage of transfected cells that were counted from viable cells in each experimental group. When we used larger concentration of plasmid DNA, we obtained higher transfection efficiency that allows to presume that larger amount of DNA was transferred into CHO cells. ĮVADAS Medžiagų srautas per biologines membranas vyksta dėl unikalios membranos sandaros ir šiuos procesus reguliuojančių mechanizmų. Biologinių membranų pralaidumą įvairiems junginiams galima padidinti paveikus jas didelio stiprio išoriniu elektriniu lauku, kuris destabilizuoja membranas, lokaliai pakeičia jų struktūrą ir lemia porų susiformavimą membranoje, dėl ko padidėja membranos pralaidumas įvairioms medžiagoms. Šis procesas vadinamas biologinių membranų elektroporacija. Tarp gyvų ląstelių, kurios yra ramybės būsenos, vidaus ir išorės yra gana stabilus elektrinių potencialų skirtumas, kuris vadinamas ramybės potencialu. Jei ląstelę paveiksime išoriniu elektriniu lauku, membraninis ląstelės potencialas bus sutrikdytas, membranoje įvyks struktūriniai pakitimai ir ląstelės bus elektroporuotos. Tinkamai parinkus elektroporacijos sąlygas, pakitimai ląstelės membranoje bus grįžtami. Dėl fizikinės prigimties ir paprastumo elektroporacija pradėta plačiai taikyti ląstelės biologijoje, biotechnologijoje, medicinoje ir pramonėje. Naudojant šį metodą in vitro, galima į ląsteles įterpti įvairias daleles nuo jonų iki oligonukleotidų, sulieti bei transformuoti ląsteles. Elektroporacija in vivo taikoma elektrochemoterapijoje priešvėžinių vaistų pernašai ląsteles, genų suleidimui į įvairius audinius, vaistų įvedimui per odą ir kt. Genų terapija yra plačiai naudojamas metodas vėžio ir kitų ligų gydymui. Virusai yra naudojami kaip genų įterpimo į ląsteles vektoriai, tačiau dėl mutagenezės ir imuninio atsako tai rizikingas genų pernašos į ląsteles būdas. Paskutiniu metu genų pernašai į ląsteles ieškoma naujų nevirusinių metodų, kurie pasižymėtų didesniu saugumu, būtų lengvai pritaikomi, nesukeltų organizmo imuninio atsako ir nebūtų toksiški. Vienas iš tokių DNR pernašos į ląsteles ar audinius būdų yra susijęs su ląstelių elektroporacija. Tačiau ši sritis reikalauja išsamių tyrimų, nes tikslus DNR pernašos per plazminę membraną mechanizmas, taikant ląstelių elektroporaciją, dar nėra pilnai suprastas. Vykdant DNR elektropernašą į ląsteles buvo pastebėta, kad išorinis elektrinis laukas atlieka dvi funkcijas: sudaro elektroporas membranoje, dėl ko padidėja membranos pralaidumas bei sukelia elektroforetines jėgas, kurios traukia DNR prie ląstelės membranos ir per ją į ląstelės vidų. Norint išsiaiškinti šių dviejų skirtingų poveikių įtaką, DNR elektropernašos efektyvumui naudojami dviejų skirtingų tipų elektrinio lauko impulsai: aukštos amplitudės, trumpi (HV) ir žemos amplitudės, ilgi (LV). Nors tikslus DNR elektropernašos į ląstelę mechanizmas nėra pilnai išaiškintas ir suprastas, tačiau manoma, kad DNR suformuoja tarpinius kompleksus su ląstelės membranos lipidais, kurių dėka vėliau patenka į ląstelės citoplazmą ir branduolį. Iškėlėme hipotezę, kad 1HV impulso poveikyje susiformavusios poros impulsui pasibaigus iškart ima mažėti, todėl tikimės, kad sumažinę laiko tarpą tarp 1HV ir 1LV impulsų, pasieksime didesnio DNR elektropernašos į CHO ląsteles efektyvumo. Darbo tikslas ir uždaviniai Šio tiriamojo darbo tikslas – naudojant aukštos amplitudės, trumpus (HV) ir žemos amplitudės, ilgus (LV) impulsus, įvertinti DNR elektropernašos į Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles in vitro efektyvumo priklausomybę nuo laiko tarpo tarp 1HV ir 1LV elektrinių impulsų. Darbo uždaviniai: 1. Naudojant 1HV+1LV impulsų kombinacijas, įvertinti suminio transfekcijos efektyvumo ir ląstelių gyvybingumo priklausomybę nuo laiko tarpo tarp 1HV ir 1LV impulsų. 2. Naudojant 1HV+1LV impulsų kombinacijas, įvertinti transfekuotų ląstelių dalies priklausomybę nuo laiko tarpo tarp 1HV ir 1LV impulsų. 3. Įvertinti DNR elektropernašos efektyvumo priklausomybę nuo GFP koduojančios ir liuciferazę koduojančios plazmidžių koncentracijos. 1. LITERATŪROS APŽVALGA 1.1. Ląstelės plazminė membrana. 1.1.1. Plazminės membranos struktūra ir funkcijos Plazminė membrana yra sudaryta iš lipidų ir baltymų. Cheminė įvairių augalinių ir gyvulinių membranų analizė parodė, kad jų sudėtyje yra 30-80 % lipidų, 20-60 % baltymų ir apie 10 % sacharidų, skaičiuojant sausos membranos svorio atžvilgiu. Į membranų sudėtį įeina šie lipidai: riebiosios rūgštys, steroliai, fosfolipidai, plazmologenai, kardiolipidai, sfingolipidai, glikolipidai bei gangliozidai [1]. Dauguma plazminės membranos lipidų yra fosfolipidai, kurie išsidėstę dvisluoksniu, todėl tokia struktūra dar yra vadinama bisluoksne lipidine membrana. Fosfolipidų hidrofilinės (polinės) galvutės yra nukreiptos į ląstelės vidaus ir išorės skysčius, o hidrofobinės (nepolinės) uodegėlės nukreiptos į membranos vidų, t. y. – atsuktos vienos į kitas [2]. 1 pav. Bisluoksnės lipidinės membranos modelis (1 – lipidų dvisluoksnis, 2 – hidrofilinė dalis, 3 – hidrofobinė dalis) [3]. Plazminės membranos fosfolipidų sluoksnis kūno temperatūroje yra tokios pat konsistencijos kaip aliejus. Kuo didesnė nesočiųjų riebalų rūgščių koncentracija, tuo dvisluoksnis yra skystesnis. Dėl fosfolipidinio sluoksnio tankumo ląstelės yra gana elastingos, jose lipidų molekulės be paliovos juda. Lipidų molekulių judėjimo rūšys: sukimasis apie išilginę ašį, segmentinė vibracija, peršokimas iš vieno lipidinio sluoksnio į kitą ir šoninė difuzija [1]. Kitas pagrindinis membranų komponentas yra baltymai. Šie baltymai dažnai turi hidrofobinę dalį. Ji būna nugrimzdusi į membraną ir hidrofilines dalis, kurios kyšo iš jos į abi puses. Yra skiriami periferiniai ir integraliniai baltymai. Membranos baltymai, kaip ir lipidai, turi įkrautas – hidrofilines ir neįkrautas – hidrofobines sritis. Įkrautos sritys dauguma atvejų yra membranos paviršiuje, kur elektrostatiškai sąveikauja su fosfolipidų įkrauta galvute ir vandens molekulėmis. Hidrofobinės baltymų sritys, apsuptos fosfolipidinių angliavandenilinių grandinėlių, sąveikauja su jomis van der valsiškai [1]. 1.1.2. Medžiagų pernaša per ląstelės membraną Plazminė membrana yra puslaidė, todėl leidžia prasiskverbti kai kuriom molekulėms. Membrana yra atrankiai laidi: vienos molekulės laisvai pereina per plazminę membraną, kitos – ne. Tai priklauso nuo membranos sandaros. Mažos, elektrinio krūvio neturinčios, lipiduose tirpios molekulės lengvai pereina per membraną. Makromolekulės, jonai ir kitos molekulės praeina sunkiai. Molekulės pernešamos per membraną aktyviai (reikalinga energija) ir pasyviai (energija nereikalinga). Pasyvioji pernaša vyksta, kai medžiagoms pernešti nenaudojama laisvoji energija. Šį vyksmą lemia antrasis termodinamikos dėsnis – medžiagos juda gradientų išnykimo kryptimi [4]. Pasyvūs būdai – difuzija, osmosas ir palengvintoji difuzija. Kad vyktų aktyvioji pernaša, reikalinga laisvoji energija. Aktyvūs būdai – aktyvioji pernaša, endocitozė ir egzocitozė. Difuzija yra vienas paprasčiausių fizikinio judėjimo pavyzdžių. Esant koncentracijų gradientui, molekulės difunduos iš didesnės koncentracijos į mažesnę. Šiuo būdu per plazminę membraną difunduoja lipiduose tirpios molekulės, dujos bei vanduo [2]. Osmosas yra tirpiklio ląstelėje vandens molekulių difuzija pro puslaides membranas, stengiantis išlyginti medžiagų koncentracijas [4]. Kad vyktų ši difuzija, reikalingas osmotinis slėgis, kuris susidaro toje membranos pusėje, kurioje didesnė ištirpusios medžiagos koncentracija. Palengvintoji difuzija vyksta, kai molekules pro membraną perneša membranose esantys baltymai nešikliai. Šie baltymai prisijungia pernešamąsias molekules, pakeičia savo formą ir taip prasiskverbia pro membraną. Taip į ląstelę patenka tokios molekulės kaip gliukozė ir aminorūgštys [2]. Aktyviajai pernašai būdingas laisvosios energijos eikvojimas, nes medžiagos pernešamos atrankiai iš mažesnės medžiagų koncentracijos erdvėskyros į didesnės medžiagų koncentracijos erdvėskyrą [4]. Baltymai, kurie dalyvauja pernašoje yra vadinami siurbliais, kurių vienas yra būdingas visoms ląstelėms ir vadinamas natrio – kalio siurbliu. Jis siurbia natrio jonus iš ląstelės, o kalio jonus – į ląstelę [2]. Egzocitozės ir endocitozės būdu į ląstelę arba iš jos patenka polipeptidai, polisacharidai ir nukleotidai. Vykstant egzocitozei, Goldžio aparate susidariusios pūslelės susilieja su plazmine membrana ir išskiriamos į ląstelės išorę. Vykstant endocitozei, pūslelės perneša medžiagas į ląstelę. 1.1.3 Ląstelės membranos biopotencialas Ląstelės gali būti sujaudintos ir ramybės būsenos. Tarp gyvų ląstelių, kurios yra ramybės būsenos, vidaus ir išorės yra gana stabilus elektrinių potencialų skirtumas, kuris vadinamas ramybės potencialu ER. Jo dydis – kelios dešimtys milivoltų. Paveikus ląsteles fiziniais dirgikliais, jose galima sukelti sujaudinimą, kurio metu vyksta ryškus trumpalaikis elektrinių potencialų skirtumo pakitimas, kuris vadinamas veikimo potencialų EV [4]. Fizikiniu požiūriu bisluoksnę lipidinę membraną galima prilyginti plokščiajam kondensatoriui. Kondensatoriaus plokštės atitinka priešingų sluoksnių įkrautos lipidinių molekulių galvutės, o dielektriką – membranos lipidinių molekulių angliavandenilinės grandinėlės [1]. Tarp įkrautų membranos sluoksnių atsiranda potencialų skirtumas. Paviršinis membranos krūvis iš dalies sąlygoja nevienodų jonų pasiskirstymą membraną supančiuose tirpaluose. Pagrindinis veiksnys, sąlygojantis nevienodą krūvių koncentraciją abipus membranos, yra natrio – kalio siurblys. Nevienodas Na+ ir K+ jonų pasiskirstymas daro įtaką ir kitų, tirpale laisvai judančių, jonų pasiskirstymui. Ląstelę ir aplinką galima įsivaizduoti kaip sistemą, sudarytą iš dviejų skirtingos jonų koncentracijos tirpalų, atskirtų pusiau laidžia membrana. Tokioje sistemoje, tarp membrana atskirtų tirpalų, atsiranda potencialų skirtumas, kuris gyvose ląstelėse neišnyksta dėl natrio – kalio siurblio nepertraukiamos veiklos. Toks potencialas vadinamas ramybės potencialų ir priklauso nuo jonų koncentracijos bei membranos laidumo jonams (K+, Na+, Cl-). A. Hodgkin ir B. Katz sudarė lygtį, išreiškiančią ramybės potencialo priklausomybę nuo laidumo šiems jonams [1]: , (1.1) kur - ramybės potencialas; PK, PNa, PCl – membranos laidumas K+, Na+, Cl- jonams;, , - atitinkamų jonų koncentracija ląstelės viduje; ,,- Šių jonų koncentracija membranos išorėje. Membranos potencialų skirtumą, sąlygojamą jonų koncentracijos skirtumo abipus membranos, galima apskaičiuoti iš Nernsto lygties [1]: (1.2) Pagal šią formulę apskaičiuotas membranos potencialų skirtumas vadinamas pusiausvyriniu potencialu. Visų ląstelių kalio jonų potencialas yra neigiamas ir svyruoja nuo (-40) iki (-100) mV, o natrio jonų – teigiamas ir svyruoja nuo (+40) iki (+70) mV. Membranos joninį laidumą galima laikyti pastoviu, kai ląstelė yra ramybės būsenoje. Ląstelės jaudinimo metu membraninis joninis laidumas kinta priklausomai nuo membranos potencialo. 1.2. Biologinių membranų elektroporacija Elektroporacija yra plačiai naudojama įvesti į ląstelę įvairioms medžiagoms, tokioms kaip jonai, vaistai, dažai, antikūniai, oligonukleotidai (RNR ir DNR), mažos organelės ir kt. Įrodyta, kad elektroporacija yra naudinga in vitro ir in vivo [5]. Viena iš daugelio priežasčių, kodėl elektroporacijos metodas yra sėkmingai taikomas medžiagų įterpimui į ląstelę ir membranai tirti, yra naudojamų eksperimentinių prietaisų paprastumas. Prietaisai susideda iš dviejų elektrodų, kurie gali būti sudaryti iš dviejų plokštelių arba adatiniai (2. pav.), patalpintų ląstelių suspensijoje [6]. Elektrodai prijungti prie aukštos įtampos impulsų generatoriaus, kuris leidžia kontroliuoti elektrinių impulsų įtampą ir trukmę. Ląstelių veikimas elektriniais impulsais sukelia porų formavimąsi ląstelės membranoje, dėl to įvyksta dalelių mainai tarp ląstelių ir jas supančios terpės. 2 pav. Adatinių ir plokštelinių elektrodų pavyzdžiai [5]. 1.2.1. Biologinių membranų poliarizacija elektriniame lauke Išorinis elektrinis laukas turi įtakos porų formavimuisi biologinėse membranose, ląstelių dielektroforeziniam judėjimui bei išsidėstymui elektriniame lauke ir membranų laidumui. Visus šiuos veiksnius lemia vienas fizikinis procesas – medžiagos poliarizacija elektriniame lauke, kuris atsiranda dėl elektrinio lauko ir krūvio sąveikos. Elektrinis laukas sukuria jėgą, priverčiančią judėti krūvį turinčias daleles, o krūvius negalinčius laisvai judėti, verčia susitelkti (3. pav.). Laisvas krūvių judėjimas priklauso nuo medžiagos laidumo. Krūvio pasiskirstymą ribotoje erdvėje charakterizuoja jo poliarizuotumas [6]. 3 pav. Ląstelės membrana riboja krūvių judėjimą, verčia juos susitelkti. Dėl išorinio elektrinio lauko poveikio įvyksta ląstelės poliarizacija. Transmembraninis poliarizuotos ląstelės potencialas yra maksimalus ląstelės poliuose ir minimalus ties ekvatoriumi [7]. Išorinio elektrinio lauko ir poliarizuotos medžiagos sąveika sukelia judesius dalelės viduje ir pačių dalelių judėjimą. Judėjimas dalelėje sukelia struktūrinius persitvarkymus ir netgi mechaninius įtrūkimus medžiagoje, kurie, jei vyksta membranose, sukelia jų elektroporaciją ir elektrinį laidumą [6]. Kintančiame elektriniame lauke gali atsirasti ir neutralių dalelių judėjimas. Taip nutinka dėl pasiskirsčiusių dalelėje krūvių tarpusavio sąveikos. Šie krūvių bendra suma lygi nuliui, bet jie reaguoja su skirtingo stiprumo elektriniais laukais. Šis reiškinys vadinamas dielektroforeze [8]. Dielektroforezė gali atsirasti ir nekintančiame išoriniame elektriniame lauke, jei ten yra kitų dalelių, sukeliančių elektrinio lauko trikdžius. Šių reiškinių rezultatas yra abipusė dalelių trauka, suartėjimas ir galiausiai – sulipimas [6]. Dalelių judėjimo dydis ir tipas priklauso nuo elektrinio lauko, prigimties ir dalelės geometrijos. Biologinės membranos turi žemą poliarizuotumą (santykinė dielektrinė konstanta ~ 2) ir žemą savitąjį laidumą (savitasis membranos laidumas yra ~ 1 mS/cm2). Jas supančios terpės dielektrinė konstanta yra didelė (~ 80) ir aukštas laidumas (~ 0,1 S/cm2) [6]. Membraninę sistemą veikiant išoriniu elektriniu lauku atsiranda membraną supančios terpės jonų judėjimas, krūvio kaupimasis membranos paviršiuje ir membranos poliarizacija. Krūvis membranų paviršiuje sukuria elektrinį lauką membranos viduje, kuris yra daug stipresnis, nei elektrinis laukas supančioje membraną terpėje. Elektrinis laukas membranoje reaguoja su poliarizuota membranos medžiaga ir sukelia vidinius membranos judesius bei struktūrinius persitvarkymus [9]. Esant pakankamai aukštam elektrinio lauko stipriui, šie vyksmai lemia porų formavimąsi ir elektrinę membranų paviršiaus iškrovą dėl jonų srauto per poras. Jei greta yra kita membrana, tai molekulinis membranos persitvarkymas gali sukelti membranų susiliejimą dėl abipusio lipidinių molekulių išsisklaidymo. Įvyksta lipidų susimaišymas ir membranų susiliejimas. Molekulinis kontaktas, reikalingas susiliejimui, gali būti sustiprintas dėl abipusės dviejų poliarizuotų membranų traukos [6]. 1.2.2. Elektrinio lauko sukuriamas transmembraninis ląstelės potencialas Kai ląstelė yra veikiama išorinio elektrinio lauko E, jos membranoje yra sukuriamas tam tikras transmembraninis potencialas Um. Tai vyksta dėl elektrinių savybių skirtumų tarp ląstelės membranos, citoplazmos ir išorinės terpės. Šis reiškinys dar žinomas kaip Maxwell – Wagner poliarizacija. Sferinių ląstelių transmembraninį potencialą, kurį sukelia išorinis elektrinis laukas, galima apskaičiuoti iš Schwan’o lygties (1.3) [9]: Um = 1,5 ER cosθ, (1.3) kur Um yra išorinio elektrinio lauko sukuriamas transmembraninis potencialas, R – ląstelės spindulys, E – išorinio elektrinio lauko stipris, θ – kampas tarp elektrinio lauko krypties ir ląstelės membranos paviršiaus taškinio vektoriaus. Ląstelėms, kurios yra audinyje ar suspensijoje, reikia papildomai įskaičiuoti vietinio elektrinio lauko sumažėjimą dėl supančių ląstelių, kurios sumažina transmembraninį potencialą Um [10]. Kai išorinio elektrinio lauko sukuriamas transmembraninis potencialas viršija slenkstinės įtampos dydį (nuo 0,2 V iki 1 V), tam tikroje ląstelės membranos dalyje atsiranda struktūriniai pakitimai ir formuojasi poros, kurių diametras gali siekti kelis nm [11]. Iš (1.3) lygties matome, kad ląstelės spindulys yra svarbus elektroporacijos proceso parametras. Transmembraninis ląstelės potencialas yra atvirkščiai proporcingas ląstelės spinduliui [6]. Ląstelės, turinčios didesnį spindulį, gali būti elektroporuotos mažesnio stiprio elektriniame lauke, o kuo ląstelės skersmuo mažesnis, tuo stipresnio elektrinio lauko reikia membranos pralaidumui pasiekti. Dėl šios priežasties, elektrinis laukas, reikalingas žinduolių ląstelių membranų pralaidumui pasiekti, yra žymiai mažesnis, nei laukas, kurio reikia kitų mažesnių ląstelių pralaidumui, pvz. bakterijų ląstelėms. Taip pat įrodyta, kad mitochondrijos ir kitos viduląstelinės organelės nėra elektroporuojamos tokio stiprumo elektriniame lauke, kurio pakanka ląstelės membranos laidumui pasiekti [5]. Tačiau naujas elektroporacijos aspektas yra toks, kad naudojant itin trumpus elektrinius nanosekundinio dažnio labai aukštos įtampos elektrinius impulsus, ląstelės organelės gali būti elektroporuotos, net ir nevykstant ląstelės membranos elektroporacijai. Tai gali būti pasiekta, naudojant tokius trumpus elektrinius impulsus, kurių trukmės nepakanka ląstelių membranoms įkrauti [12]. Kitas aspektas yra elektrinio lauko stipris membranoje Um, kuris yra daug didesnis už išorinio elektrinio lauko stiprį E ir priklauso nuo padėties ląstelės membranoje. Ląstelės poliuose, kur θ = 00, sukeltas potencialas yra maksimalus, kai θ = 900, potencialas lygus nuliui [6]. Membranos įkrovimo laikas yra dar vienas svarbus elektroporacijos parametras. Jis ilgėja didėjant savitajai varžai ir ląstelės spinduliui. Elektrinio impulso trukmė visada turi būti ilgesnė už įkrovimo laiką, reikalingą maksimaliam transmembraniniam potencialui pasiekti [6]. 1.2.3. Dalelių skvarba per elektroporuotas membranas Jonų ir fluorescencinių dažų skverbimasis per elektroporuotą membraną dažnai yra asimetrinis [6]. Ląstelės pralaidumas pirmiausia atsiranda tame ląstelės poliuje, kuris yra atsuktas į teigiamą elektrodą. Dėl neigiamai įkrauto ląstelės vidaus, jos polius prie teigiamo elektrodo yra būtent tas membranos plotas, kuriame ląstelės membranos talpinė varža yra viršijama pirmiausiai, kai ląstelė paveikiama išorinio elektrinio lauko [5]. Sekantis vyksmas, yra ląstelės membranos pralaidumo atsiradimas tame poliuje, kuris yra atsuktas į neigiamą elektrodą (katodą). Membranos pralaidumo laipsnis (elektroporuotos membranos plotas) ląstelės poliuje, kuris yra prie teigiamo elektrodo (anodo), gali buti kontroliuojamas impulsų amplitudės, t. y. kuo aukštesnė elektrinio impulso amplitudė, tuo didesnis membranos plotas, kuriame gali vykti difuzija. Ląstelės membranos pralaidumo laipsnį galima kontroliuoti elektrinio impulso trukme. Kuo ilgesnis impulsas, tuo didesnis membranos pralaidumas veikimo plote [13]. Įrodyta, kad membranos pralaidumo plotas yra didesnis tame ląstelės poliuje, kuris atsuktas į teigiamą elektrodą, bet membranos pralaidumo laipsnis didesnis poliuje prie neigiamo elektrodo. Taigi, didesnės molekulės difunduos į ląstelę membranos vietoje prie neigiamo elektrodo, bet plotas, per kurį gali vykti difuzija, bus didesnis prie teigiamo elektrodo [14]. Elektroporacija vyksta tose membranos dalyse, kur išorinio elektrinio lauko sukeltas transmembraninis potencialas viršija slenkstinės įtampos dydį, t. y ∣Um∣>Uc [11]. Elektroporuota ląstelės membranos dalis charakterizuojama kritiniu kampu θc, kur Uc = 1,5ERcosθc. Jeigu θc = 0, tai Ec= Uc/1,5R. Gaunama formulė, kuri charakterizuoja dviejų sferinių ląstelės paviršiaus viršūnėlių plotą (4. pav.), kurį veikia didesnis už slenkstį transmembraninis potencialas [9]: Sc = S0(1 - Ec/E), (1.4) kur S0 bendras vienos ląstelės plotas. Iš lygties (1.4) ir schemos (4. pav.) tampa aišku, kad elektrinis laukas E yra kritinis membranos pralaidumo parametras, nes jis apibrėžia membranos plotą Sc, per kurį vyksta jonų ir molekulių transportas. 4 pav. Sferinė ląstelė, patalpinta elektriniame lauke. Šviesiai pažymėtos dalys nurodo plotą, kurį veikia didesnis už slenkstį membraninis potencialas. Šis plotas gali būti apskaičiuotas iš lygties (1.4) [9]. Membranos pralaidumo jonams ir molekulėms padidėjimą nusako lygtis [9]: fper = S/Stot = Spor/S0, (1.5) kur Spor yra vienos ląstelės porų plotas, S – bendras visų porų plotas, S0 – vienos ląstelės plotas ir Stot – bendras N ląstelių plotas. fper faktorius apibūdina ilgai gyvuojančias poras, kurios yra pakankamai didelės, kad padidintų pralaidumą, kuris charakterizuoja padidintą jonų ir molekulių difuziją per ląstelės membraną. Ši difuziją vyksta tik per ląstelės plotą Sc (lygtis (1.4)). Galima išvesti difuzijos lygtį, kuri aprašo molekulių srautą, vykstantį dėl koncentracijos gradiento per elektroporuotas membranos dalis: , (1.6) kur fper = fpc(1 – Ec/E) ir fpc(E, tE, N) = Spor/Sc aprašo porų santykį elektroporuotuose ląstelės regionuose, E – elektrinio lauko stipris, ne – išorinėje terpėje esančių molių skaičius, D – difuzijos konstanta, ce – molinė koncentracija ląstelės išorėje, ci – molinė koncentracija ląstelės viduje, tE – elektrinio impulso trukmė, N – impulsų skaičius. Membranų pralaidumo pokytis gali būti pilnai grįžtamas – kai tinkamai parenkama terpė ir elektrinio impulso sąlygos, membranoje susidariusios elektroporos turi ribotą gyvavimo periodą [15,16,17]. Elektroporacijos metu, membranoje atsiranda dviejų tipų pralaidumas – trumpalaikis ir ilgalaikis. Trumpalaikis membranos pralaidumas atsiranda elektrinio impulso metu (trumpalaikis pralaidumo padidėjimas), o ilgalaikis ląstelės membranos pralaidumas atsiranda po elektrinio impulso arba tarp impulsų, dėl jonų ištekėjimo iš ląstelės [9]. 1. 3. Porų formavimosi membranoje teorijos Kai elektroporacijos metu transmembraninis potencialas pasiekia slenkstinės įtampos dydį, membranos poracija vyksta mikrosekundiniame laiko tarpsnyje. Kuo ilgesni elektriniai impulsai veikia membraną, tuo didesnės poros formuojasi joje [18]. Ląstelių membranų atsistatymas po elektroporacijos trunka kelias milisekundes, o visiškas ląstelių membranų atsistatymas gali trukti kelias sekundes, minutes ar netgi valandas. Labai ilgos trukmės ir aukštos įtampos elektriniai impulsai gali sukelti negrįžtamą membranų destabilizaciją ir po jos sekantį membranų suirimą [19]. Nors porų formavimasis įvyksta mikrosekundiniame laiko tarpsnyje, membranų prasiskyrimas vyksta minučių intervale [5]. Du pagrindiniai teoriniai modeliai, aiškinantys biologinių membranų elektroporaciją, yra elektromechaninis ir energetinis. Jie atsirado iš fizikinių teorijų apie kondensuotą medžiagą ir fizikinės chemijos teorijos apie plonas skysčio plėveles [6]. 1.3.1. Elektromechaninis membranų elektroporacijos modelis Elektromechaniniu požiūriu membranos laikomos elastiniais [20] ar viskoelastiniais kūnais [21,22], kuriems taikoma elastingumo ir fizikinės chemijos teorijos apie plonas skysčio plėveles principai. Pagrindinė šio požiūrio išvada yra tokia, kad egzistuoja kritinis membraninis potencialas, kurį viršijus, membrana tampa nestabili ir galiausiai praplyšta [6]. Nustatyta kritinės įtampos vertė atitinka eksperimentinius duomenis. Vienintelė šio būdo problema yra ta, kad esant nustatytajai kritinei įtampai, membranos sluoksnio storis turėtų būti sumažintas apie 40%. Tai reiškia, kad nesuspaudžiamos membranos paviršiui yra būdingas nepaprastas plėtimasis, kas eksperimentiškai nėra patvirtinta [23]. Buvo pasiūlyti du problemos sprendimo būdai. Detaliai atsižvelgta į membranos paviršiaus įtemptį ir membranos plyšimus, kurie, kaip manoma, kyla dėl nestabilių membranos paviršiaus terminių fluktuacijų [21]. Spėjama, kad vidutinis membranos sluoksnis gali būti reikšmingai nepakeistas, bet membrana gali plyšti tam tikrose vietose dėl didėjančių paviršiaus formų nestabilumų. Kitas pasiūlytas didelio membranos sluoksnio pokyčio problemos sprendimas susijęs su membranos įtemptimi. Apskaičiuota membranos įtemptis (mechaninis slėgis membranoje), kurį sukelia išorinis elektrinis laukas [23] ir pateikta prielaida, kad membrana plyšta esant tam tikram kritiniam įtempimui, kuris atitinka membranos ploto pokyčius. Šis sprendimas nenumato teorinės kritinės įtampos vertės, bet postuluoja šios įtampos buvimą. Tačiau šis siūlymas neleidžia teoriškai nuspėti kritinės įtampos priklausomybės nuo elektrinio impulso trukmės. Buvo pasiūlytas kitas būdas, pagrįstas viskoelastinės membranos tamprumu [21]. Pagal viskoelastinį membranos elektroporacijos modelį, išorinis elektrinis laukas sukelia nestabilų ir augantį membranos paviršiaus bangavimą, kurio dažnis proporcingas membranos klampumui. Membrana plyšta kai greičiausiai augančios perturbacijos amplitudė tampa lygi membranos sluoksnio storiui [24]. Nors šis siūlymas neprieštarauja duomenims apie ląstelių membranas, tačiau pagal šį modelį negalima numatyti ar taip susidariusios poros plečiasi ir negrįžtamai pažeidžia membraną. 1.3.2. Energetinis membranų elektroporacijos modelis Ši teorija, apibūdinanti porų susidarymą ir plėtimąsi elektriniame lauke, remiasi svarstymais apie energiją [25]. Manoma, kad laisvoji porų energija yra suma dviejų komponentų, kurių vienas susijęs su paviršine energija, o kitas susijęs su kraštine porų energija (linijine įtemptimi). Paviršiaus energijos komponentai išplečia poras, o kraštinės energijos komponentai jas uždaro. Kai poros spindulys viršija ribinę vertę, kuri lygi paviršiaus energijos tankio ir porų kraštinės energijos santykiui, poros spontaniškai plečiasi, kol membrana plyšta. Poros su mažesniu už kritinį spinduliu, turi pereiti energijos barjerą, tam kad jų spindulys taptų didesnis už kritinį. Laikas, reikalingas šiam procesui, yra atvirkščiai proporcingas Boltzmann faktoriui exp(–Ea/kT), kur Ea yra energijos barjero aukštis, k – Boltzmann konstanta, T – absoliučioji temperatūra [9]. Veikiant membraną išoriniu elektriniu lauku, sumažėja porų energija, nes vyksta vandens molekulių, esančių porose, poliarizacija, kuri yra didesnė nei kitų membranos komponentų poliarizacija. Energijos barjeras sumažėja koeficientu, kuris yra proporcingas transmembraninio potencialo kvadratui [9]. Tai sutrumpina laiko periodus, reikalingus energijos barjerui įveikti ir pasiekti kritinį porų spindulį. Tačiau šis modelis kaip ir elektromechaninis nėra paprastas ir nenumato skirtumų tarp hidrofobinių ir hidrofilinių porų. Manoma, kad poros, per kurias vyksta molekulių pernaša, yra hidrofilinės ir susiformuoja iš hidrofobinių porų (5. pav.). Hidrofobinių porų egzistavimo tikimybę apibrėžia porų energijos priklausomybė nuo poros spindulio dydžio, o tam kad iš hidrofobinės poros susiformuotų hidrofilinė, reikia įveikti tam tikrus kinetinius barjerus. Hidrofobinių ir hidrofilinių porų energijos palyginimas rodo, kad hidrofobinės poros formavimasis membranos bisluoksnyje yra energetiškai palankesnis, kai poros spindulys yra labai mažas. Hidrofobinių porų gyvavimo trukmė yra maždaug tokia, kiek trunka lipidinio sluoksnio bangavimas. Jos yra tik pereinamoji hidrofilinių porų formavimosi stadija. Kai hidrofobinės poros pasiekia kritinio spindulio vertę, ir jų energija susilygina su hidrofilinių porų energija, lipidinių molekulių persitvarkymas tampa energetiškai palankesnis [26]. Net ir esant nuliniam transmembraniniam potencialui, hidrofilinės poros yra metastabilios, dėl energetinio porų prasivėrimo barjero egzistavimo, kuris neleidžia joms užsiverti [17,27]. 5 pav. Lipidinės membranos porų tipai: (A) hidrofobinė pora, (B) hidrofilinė pora [26]. Detalus porų virsmas hidrofilinėmis nėra žinomas. Porų formavimasis elektriniame lauke neatmeta galimybės, kad prieš elektroporaciją egzistuojančios membranos poros taip pat gali tarnauti kaip didesnių porų formavimosi pradmuo [28]. 1.4. DNR elektropernaša į ląsteles Nors pirmieji pranešimai apie plazmidinės DNR elektropernašą buvo paskelbti daugiau nei prieš 20 metų [29], tačiau pats elektropernašos mechanizmas iki šiol dar nėra iki galo suprastas. Buvo pateikta nemažai proceso paaiškinimų. Paprasčiausias yra tas, kuris aiškina, kad membrana iš pradžių yra elektroporuojama, tada DNR plazmidė yra tempiama į ląstelę per spėjamo dydžio poras veikiant elektroforetinei jėgai. Kitas galimas spėjimas aiškina, kad elektrinis laukas sukelia joninių membranos siurblių agregaciją, ir taip atveriamas kelias DNR plazmidei į ląstelę. Kita teorija aiškina, kad DNR suformuoja įkrautą pūslelę, kuri į ląstelę patenka endocitozės būdu [30]. Membranų modelių tyrimo metu, buvo tiriama DNR sąveika su lipidine membrana. DNR buvo injekuota į viensluoksnės membranos vezikulę. Buvo užfiksuota DNR sukelta endocitozė nesant elektriniam laukui. Vienas iš galimų DNR ir lipidų membranos sąveikos būdų yra DNR įsiterpimas tarp invertuotos micelės lipidinėje membranoje. Kituose pranešimuose skelbiama, kad DNR elektropernašą per lipidinę membraną galbūt sukelia laikinų kompleksų tarp DNR ir lipidų hidrofilinių porų kraštų formavimasis [31]. DNR yra ne tik laikinai įterpiama, bet ir iš tikrųjų elektroforetiškai tempiama per pralaidžias membranos vietas link kitos membranos pusės, palikdama lipidų dvisluoksnį nepažeistą [32]. 1.4.1. DNR elektroforezė ir ją ribojantys veiksniai DNR elektropernaša į ląsteles yra vektorinis procesas, kurio kryptis yra tokia pati, kaip ir DNR elektroforezės esant išoriniam elektriniam laukui [33]. DNR transfekcijos efektyvumas yra žymiai didesnis toje ląstelės dalyje, kuri yra atsukta į katodą, lyginant su priešinga ląstelės puse, kuri atsukta į anodą. Tai vyksta dėl elektroforezės, dėl kurios polianijoninė DNR yra perkeliama per elektroporuotą memebraną [34]. Elektrinio lauko poliariškumas tiesiogiai veikia DNR transfekciją, nes neigiamai įkrautos DNR transfekcijos efektyvumas priklauso nuo elektrinio lauko krypties ir elektroforetinių jėgų dalyvavimo šiame procese [33]. Dviejų impulsų naudojimo metodas leido atskirti du efektus, kuriuos sukelia elektrinis laukas: membranos pralaidumą ir DNR elektroforezę. Pirmasis aukštos įtampos, trumpas impulsas sukelia membranos pralaidumą. Antrasis žemos įtampos, ilgas impulsas nesukelia pralaidumo, bet sukelia DNR elektroforezę. Tyrimai parodė šių impulsų derinimo privalumus [35]. DNR elektropernaša yra daugiapakopis procesas [30]. Prieš paveikiant elektriniu lauku, membrana elgiasi kaip barjeras, kuris neleidžia DNR plazmidei patekti į ląstelę. Elektrinio impulso metu, membrana yra elektroporuojama tose vietose, kurios atsuktos į elektrodus ir neigiamai įkrauta DNR molekulė elektroforetiškai migruoja link plazminės membranos prie katodo pusės, kur yra įterpiama į tam tikras membranos sritis. Po elektrinio impulso poveikio, vyksta plazmidės translokacija į citoplazmą. Sekantis procesas, kurio metu DNR difunduoja į citozolį ir pereina branduolio poras yra neišaiškintas (6 pav.). 6 pav. Daugiapakopis DNR elektropernašos mechanizmas. Prieš paveikiant elektriniais impulsais, membrana yra nepralaidi DNR plazmidei. Elektrinio impulso metu: membrana tampa pralaidi (1); DNR elektroforetiškai migruoja link membranos (2); DNR sąveikauja su membrana (3). Po elektrinio impulso poveikio: DNR perkėlimas per membraną (4); viduląstelinės DNR migracija (5); DNR įsiterpimas į ląstelės branduolį (6); Genų ekspresija (7). [30] Reikia atlikti daug tyrimų norint charakterizuoti membranos sritis, kurios dalyvauja DNR elektropernašoje. Šių sričių dydis yra panašios eilės, kaip ir taip vadinami membranos plaustai. Tai yra tam tikros membranos sritys, kuriose gausu sfingolipidų ir cholesterolio. Šios sritys tarnauja kaip platformos įvairiems ląsteliniams veiksniams: signalo perdavimui ir junginių transportavimui [30]. Citoplazma sudaryta iš mokrofilamentų ir mikrotubulių sistemos, taip pat iš įvairių organelių. Visa ši sistema riboja makromolekulių difuziją. Turėtų būti tam tikras mechanizmas, padedantis DNR molekulėms įveikti citoplazmoje esančias kliūtis. Vienas iš būdų yra panašus į daugumos virusų veikimą. DNR plazmidės gabenamos kaip krovinys citoskeleto motorinių baltymų tiesiai link branduolio [36]. Galiausiai, ne tik ląstelės citoskeletas yra ribojantis DNR difuzijos veiksnys. Paskutinė kliūtis yra branduolio apvalkalas. Mažesnės nei 40 kDa molekulės gali laisvai difunduoti per branduolio poras, tuo tarp didesnės molekulės turi pasižymėti specialiais signalais. Dėl didelio plazmidinės DNR dydžio (2 – 10MDa) tampa neįtikima tai, kad DNR praeina pro branduolio membraną pasyvios difuzijos būdu [30]. Besidalijančios ląstelės turi didesnį pralaidumą už esančias ramybės būsenoje, todėl manoma, kad DNR patenka į branduolį mitozės metu. Ląstelių sinchronizacija iš tikrųjų turi įtakos genų pernašai elektroporacijos metu, nes tirpstanti branduolio membrana palengvina DNR plazmidės patekimą į ląstelę [37]. Kita siūloma alternatyva susieta su viduląstelinių komponentų elektroporacija. Dėl labai trumpų nanosekundinių impulsų (10 – 300ns) gali kilti vidulastelinių struktūrų, tame tarpe ir branduolio apvalkalo, elektroporacija. Tai palengvintų DNR patekimo į ląstelės branduolį mechanizmą [30]. 1.4.2. DNR ir ląstelės membranos kompleksai Elektrinio impulso metu, ląstelės plazminė membrana tampa pralaidi tose pusėse, kurios nukreiptos į elektrodus [38]. Plazmidės yra elektroforetiškai tempiamos prie ląstelės paviršiaus ir sąveikauja su pralaidžia puse, kuri yra atsukta i katodo pusę. Plazmidės ir membranos sąveikos dėka susiformuoja lokalizuoti agregatai. Šie kompleksai susiformuoja sekundės bėgyje po elektrinio impulso poveikio ir plazmidės yra stabiliai fiksuojamos membranoje. Jie nėra išardomi, net ir paveikus priešingo poliškumo impulsu [39]. Toks kompleksas išsilaiko iki 10 minučių po elektrinio impulso poveikio. Vėliau plazmidė difunduoja į ląstelės citoplazmą ir pasiekia branduolį po 30 minučių. Eksperimentiniai tyrimai [40, 41] ir molekulinis modeliavimas [42] iškėlė teiginį, kad plazmidinė DNR migruoja į ląsteles formuodama tarpinius lipidų ir plazmidės kompleksus. Šie kompleksai yra suformuojami elektrinio impulso metu. Kai elektrinis laukas yra pašalinamas, vyksta struktūriniai pokyčiai, kurių metu plazmidė lėtai yra perkeliama į citoplazmą. DNR elektropernaša vyksta ne tik dėl didelių porų, atsirandančių ląstelėje. Spėjamas trupai egzistuojančių porų diametras nėra ribinis DNR elektropernašos veiksnys, nes net ir didelės plazmidinės DNR molekulės gali būti ekspresuojamos po elektropernašos. Taip pat atliktuose tyrimuose [43, 44] parodyta, kad kintantis elektrinio impulso poliariškumas ir kryptis padidina plazmidinės DNR kiekį, kuri sąveikauja su ląstelės membrana, o tai padidina transfekcijos efektyvumą. Norint vizualizuoti DNR ir membranos sąveiką, buvo atlikti DNR elektropernašos tyrimai naudojant fluorescuojančius DNR žymenis. DNR plazmidė (pEGFP-C1) buvo nudažyta oranžiniu tiazolio homodimero dažu (TOTO-1) [45]. Buvo vykdoma DNR elektropernašą, naudojant vienos ir abiejų krypčių poliškumo impulsus. Po DNR elektropernašos, ląstelės buvo fotografuojamos invertuotu fluorescentiniu mikroskopu. Nuotraukose matoma DNR ir ląstelės membranos sąveika (7 pav.). 7 pav. DNR ir ląstelės membranos sąveikos atvaizdavimas naudojant vieno poliškumo elektrinį lauką (a) ir dvigubo poliškumo elektrinį lauką (b). Fazinio kontrasto (1) ir fluorescencinės nuotraukos (2) buvo fotografuotos inversiniu fluorescenciniu mikroskopu [45]. Kai buvo naudojamas vieno poliškumo elektrinis laukas, DNR sąveika su membrana matoma tik vienoje ląstelės pusėje (membranos dalyje, kuri buvo prie katodo). Kai naudojamas dviejų polių elektrinis laukas, DNR sąveika su ląstelės membrana matoma abiejose ląstelės pusėse [45]. Kaip buvo minėta, kintantis elektrinio impulso poliariškumas ir kryptis padidina plazmidinės DNR kiekį, kuri sąveikauja su ląstelės membrana, o tai padidina transfekcijos efektyvumą. 1. 5. Kiti elektroporacijos taikymo principai 1. 5. 1. Priešvėžinių vaistų įterpimas į ląsteles Veikiant ląstelės plazminę membraną stipriais išorinio elektrinio lauko impulsais, membranoje susidaro poros, per kurias į ląstelių citoplazmą lengviau patenka didesnės molekulinės masės junginiai, kurie normaliomis sąlygomis per membraną neprasiskverbia. Elektroporuojant ląsteles, į jas galima įvesti įvairias medžiagas, vienos iš kurių yra antinavikinis vaistas bleomicinas. Bleomicinas yra glikopeptidinis chemoterapijoje naudojamas hidrofilinis ir stipriai citotoksiškas antibiotikas [46], kurį sintetina Streptomyces verticillus bakterijų rūšis [47]. Bleomicinu gydomi tokie vėžiniai susirgimai kaip limfoma, odos vėžys (melanoma), pleuros vėžys, žvynligė, sėklidžių bei kiaušidžių vėžys ir kt. Bleomicinas inicijuoja viengubos ir dvigubos vijų DNR struktūros sukarpymą ląstelėse ir taip sutrikdo paveiktos ląstelės ciklą. In vitro tyrimuose bleomicinas su metalų jonais sudaro chelatus, o su deguonimi – pseudofermentą. Tas fermentas reaguoja su deguonimi ir gamina superoksidus ir hidrooksidus. Jie gamina laisvuosius radikalus, kurie ardo DNR [47]. Dar šie kompleksai inicijuoja lipidų peroksidaciją ir kitu organelių oksidaciją. Šiuos vaistus galima įvesti į ląsteles tiek in vitro, tiek ir in vivo eksperimentų metu. Pirmiausia šis vaistas buvo išbandytas ląstelėms in vitro, o pastebėjus teigiamą poveikį, vėliau atlikti bandymai su ląstelėmis in vivo. Taikant elektroporaciją, bleomicino poveikis išauga net iki 700 kartų [48], todėl vėžio gydymui reikalinga vaisto dozė žymiai sumažėja. 1. 5. 2. Fluorescuojančių markerių įterpimas į ląsteles Fluorescuojantys markeriai – tai fluorescuojančios molekulės bei junginiai, iš kurių vienas yra propidžio jodidas. Tai 668 Da dydžio fluorescuojantis DNR dažas, kuris normaliomis sąlygomis į ląstelės vidų nepatenka dėl ląstelę supančios plazminės membranos [49]. Įvairūs ląstelių pažeidimai padidina membranos pralaidumą šiam dažui. Kadangi šis dažas nepatenka į gyvybingų ląstelių vidų, todėl dažniausiai yra naudojamas žuvusiom ląstelėms identifikuoti. Šiuo atveju jis prasiskverbia pro pažeistą ląstelės membraną ir patekęs į ląstelės branduolį jungiasi su DNR ir RNR, dėl to padidėja šio junginio fluorescencija [50]. Jis fluorescuoja ryškią raudona šviesa. Dažniausiai naudojamas tyrimams in vitro, tačiau manoma, kad šis dažas gali būti naudingas ir tyrimuose in vivo, nes identifikuotų membranų vientisumą gyvuose audiniuose. 1. 5. 3. Ląstelių elektrosuliejimas Dviejų ar daugiau ląstelių susiliejimas gali būti sukeltas tų pačių elektrinių impulsų, kurie naudojami elektroporacijoje [6]. Šis procesas gali įvykti tada, kai elektroporacijos metu liečiasi ląstelių membranos, tačiau tikslus molekulinis mechanizmas, sukeliantis ląstelių susiliejimą, nėra detaliai išaiškintas [51]. Manoma, kad ląstelė tampa pralaidi, kai membranos potencialų skirtumas pasiekia tam tikrą kritinę ribą. Kai ląstelės sugrįžta į normalią būseną, gali įvykti dviejų ląstelių konjungacija, t.y. poroms užsiveriant vienos ląstelės membrana gali susijungti su kitos ląstelės membrana [27]. Šis metodas gali būti panaudotas medžiagų pernašai iš vienos ląstelės į kitą. 2. MEDŽIAGOS IR METODAI 2.1. Ląstelių kultūros paruošimas 2.1.1. Ląstelių auginimas Tyrimams in vitro naudojamos Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląstelės (Neurochemistry Centre of Strasbourg, France). Šios ląstelės augintos monosluoksniu steriliuose 75 cm2 talpos flakonėliuose (Greiner Bio-one, GmbH, Frikenhausen, Vokietija) su 5 ml augimo terpės – DMEM (Dulbecco‘s modifikuota Eagle‘s terpė, Sigma). Flakonėliai su ląstelių kultūra buvo laikomi inkubatoriuje (NU-2500E Nuaire, JAV), kuris palaiko 370C temperatūros drėgną, 5% CO2 prisotintą aplinką. Flakonėlio dangtelis paliekamas prasuktas tam, kad į flakonėlio vidų galėtų patekti CO2, kuris reikalingas augimo terpės pH pusiausvyrai palaikyti. Augimo terpė ruošiama iš 10% FBS (embrioninio jaučio serumo (Sigma)), 1% L-glutamino tirpalo (Life Technologies), 100 U/ml penicilino ir 100 μg streptomicino antibiotikų (Sigma). Augimo terpė savo sudėtyje turi visas pagrindines medžiagas, kurios reikalingos ląstelių kultūros auginimui: amino rūgščių, vitaminų, druskų, hormonų ir augimo faktorių (FBS), energijos šaltinį (L-glutaminas) ir antibiotikų (penicilinas ir streptomicinas) infekcijos profilaktikai. Siekiant apsaugoti auginamą ląstelių kultūrą nuo infekcijos, buvo dirbama steriliomis sąlygomis vertikalaus srauto laminare (BIOAIR instruments, Aura vertical S.D.4, Italija) ir naudojamos vienkartinės sterilios priemonės. Prieš persėjimą ar eksperimentą įvertinamas sėjimui skirtas ląstelių monosluoksnis, terpės spalva ir drumstumas. Augant ląstelių kultūrai stebimas terpės spalvos pasikeitimas iš rausvos į geltoną, nes reaguoja terpėje esantis indikatorius – fenolio raudonasis, kuris parodo terpės parūgštėjimą. Galimas terpės padrumstėjimas, kuri sukelia nuo substrato nuslenkančios ląstelės arba infekcija. Ląstelių monosluoksnis, esantis flakonėlyje, apžiūrimas ir įvertinamas invertuotu mikroskopu (Nikon elipse TS 100, Japonija). 2.1.2. Ląstelių suspensijos paruošimas eksperimentams Ruošiant ląsteles eksperimentams, nupilama auginimo terpė. Ląstelių sluoksnis užpilamas 1ml tripsino/EDTA tirpalo (Sigma), taip nuplaunama sena terpė ir žuvusios ląstelės. Jis iškart išpilamas. Tuomet ląstelių sluoksnis užpilamas 2 ml tripsino/EDTA tirpalo (Sigma) ir paliekamas inkubatoriuje 2 – 5 min. tam, kad ląstelių monosluoksnis pilnai atsiskirtų nuo flakonėlio dugno. Po to ląstelių suspensija papildoma 2 ml augimo terpės (tiek pat, kiek buvo įpilta tripsino) tam, kad sustabdytume tripsino poveikį. Ląstelių suspensija perpilama į 15 ml talpos mėgintuvėlį ir centrifuguojama 5 min. 1000 aps/min greičiu centrifugoje (OPN-3YXL4, Rusija). Supernatantas nupilamas, o nusėdusios ląstelės suspenduojamos 1 ml augimo terpės arba mažo laidumo eksperimentinės EP terpės (10 mM fosfato, 250 mM sacharozės, 1 mM MgCl2, pH 7.2), jei su ląstelėmis bus eksperimentuojama. Tokiu būdu paruošiama ląstelių suspensija, kurios tankis – X ląstelių/ml. Ląstelių tankis X apskaičiuojamas naudojant Neubauer kamerą (Neubauer improved, Heinz herenz Medizinalbedarft, Vokietija). Šio tiriamojo darbo metu atliktuose eksperimentuose naudojome ląstelių suspensiją, kurios tankis – 2 × 106 ląstelių/ml. 2.1.3. Ląstelių skaičiavimas Neubauer kameroje Neubauer kamera (Neubauer improved, Heinz herenz Medizinalbedarft, Vokietija) turi dvi specialiai graviruotas kameras. Kiekviena kamera yra 1,0 mm × 1,0 mm dydžio kvadratai, atskirti vienas nuo kito triguba linija. Kiekvienas kampinis kvadratas yra padalintas į 16 mažesnių kvadratų. Tai padeda orientuotis skaičiuojant ląsteles ir išvengti ląstelių pakartotinio skaičiavimo. Centrinis 1 mm2 kvadratas yra padalintas į 25 mažus kvadratus (0,04 mm2), kiekvienas iš jų padalinti dar į 16 kvadratėlių (6. pav.). Jie skirti ląstelių skaičiavimui naudojant didesnį padidinimą. 8 pav. Neubauer kamera [52] Į mėgintuvėlį dedama 10 μl ląstelių suspensijos bei 90 μl tripano mėlio dažų ir gerai sumaišoma. Ant Neubauer kameros papučiama drėgnu oru ir atsargiai prispaudžiamas dengiamasis stiklelis, kol pasirodo Niutono žiedai (matomos vaivorykštės spalvų juostos). Neubauer kamera užpildoma paruošta ląstelių ir tripano mėlio suspensija naudojant automatinę pipetę plonu antgaliu, ją priliečiant prie kameros krašto. Žiūrint per mikroskopą keturiuose dideliuose kampiniuose kvadratuose suskaičiuojamos ląstelės. Skaičiuojant ląsteles reikia pasirinkti kaip skaičiuoti ląsteles esančias ant linijų. Galima skaičiuoti ląsteles kvadrato viduje ir ant kairės bei apatinės linijos arba kvadrato viduje ir ant viršutinės bei dešinės linijos. Suskaičiavus ląsteles visuose keturiuose kampiniuose kvadratuose, gautos vertės sumuojamos ir pagal formulę (2.1) apskaičiuojamas bendras ląstelių skaičius N, kuris parodo kiek ląstelių yra 1ml pradinės ląstelių suspensijos: N = A x B = 2500, (2.1) kur: A – suspensijos praskiedimas tripano mėliu; B – ląstelių skaičius keturiuose kampiniuose kameros kvadratuose; 2500 – konversijos į ml faktorius. 2.2. Naudoti prietaisai 2.2.1. Elektroporatorius Eksperimentuose buvo naudojamas impulsinis elektroporatorius (9 pav.), sukonstruotas Kauno Technologijos ir Vytauto Didžiojo universitetuose ir generuojantis platesnio diapazono trukmės, didelės galios impulsus bei įvairias šių impulsų serijos kombinacijas. Elektroporatorius valdomas vidine klaviatūra, kuria galima nustatyti šiuos išvardintus parametrus: • HV amplitudę (10 – 1200 V), • HV impulso trukmę (1 ms – 1 s); • pauzę tarp HV impulsų (1 ms – 1 s); • HV impulsų skaičių (0 – 9); • pauzę tarp HV ir LV impulsų sekų (1 μs – 6 s); • LV amplitudę (1 – 105 V); • LV impulso trukmę (10 ms – 2 s); • pauzę tarp LV impulsų (10 ms – 1 s); • LV impulsų skaičių (0 – 9). 9 pav. Impulsinis elektroporatorius. Vytauto Didžiojo universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Biofizikinių tyrimų laboratorija. Ląstelių suspensijos elektroporacijai naudoti fiksuoto atstumo plokšteliniai elektrodai, sukonstruoti VDU Biologijos katedroje (10 pav.). Tai nerūdijančio plieno plokštelės, 20 mm ilgio ir 8mm pločio, tarp kurių dedama 2mm storio plastmasinė plokštelė, dvi tokios plokštelės tvirtinamos elektrodų šonuose, elektrodų konstrukcija sujungiama plastikiniais varžtais, tokiu būdu elektrodai izoliuojami vienas nuo kito. Taip tarp elektrodu sudaromas 2 mm tarpas. Tarp šių lygiagrečių elektrodų eksperimentų eigoje talpinamas 50 μl ląstelių suspensijos lašas. 10 pav. Plokšteliniai nerūdijančio plieno elektrodai. Vytauto Didžiojo universitetas, Gamtos mokslų fakultetas, Biofizikinių tyrimų laboratorija. 2.2.2. Fluorescencinis mikroskopas Ląstelių fluorescencijos įvertinimui naudojamas fluorescencinis mikroskopas Motic BA400 (Motic, Vokietija). Nuotraukos fiksuojamos naudojant spalvotą Moticam 2300 aukštos skiriamosios gebos skaitmeninę kamerą (iki 3900 x 3090 pikselių). Optimaliam nuotraukos ryškumui reikalingas apšvietimo intensyvumas parenkamas programiškai kiekvienai nuotraukai. Vaizdas fiksuojamas naudojant Moticam 2300 spalvotą vaizdo kamerą. Vaizdo išreiškimas skaitmenine forma ir jo apdorojimas atliekamas naudojant kompiuterinę programą „Motic Images Plus Version 2.0“, nuotrauka išsaugojama jpg formatu. 2.2.3. Liuminometras Ląstelių liuminescencijos įvertinimui naudojamas multifunkcinis plokštelių skaitytuvas TECAN Genios Pro (TECAN, Austrija). Genios Pro palaiko šias matavimo funkcijas: fluorescencijos intensyvumą; fluorescenciją pagal laiką; fluorescencijos poliarizaciją; staigią fluorescenciją; sugertį; sugertį su purškikliais; chemi- ir bioliuminescenciją; bioliuminescencijos rezonanso energijos perdavimą; staigią liuminescenciją. Bet koks mikroplokštelių formatas nuo 6 iki 384 šulinėlių matuojamas taikant bet kokias pasirinktas matavimo technikas, kurios pilnai automatizuotos ir valdomos naudojant XFluor4 Genios Pro V 4.63 kompiuterinę programą. Ši programa leidžia valdyti Genios Pro iš Microsoft Excel kompiuterinės programos. Rezultatai pateikiami ir išsaugojami xls formatu. 2.3. DNR elektropernašos į ląsteles eksperimentų eiga 2.3.1. GFP koduojančios plazmidės elektropernašos į CHO ląsteles nustatymas Ląstelės suspenduojamos eksperimentinėje mažo laidumo terpėje (10 mM fosfato, 250 mM sacharozės, 1 mM MgCl2, pH 7.2). Taip paruošiama ląstelių suspensija, kurios tankis – 2 x 106 ląstelių/ml. Į 1,5 ml mėgintuvėlius (Ependorf Research, SAFE-LOCK) įdedama 5 μl GFP ir 45 μl paruoštos ląstelių suspensijos. Toks 50 μl lašas talpinamas tarp dviejų plokštelinių elektrodų (atstumas 2 mm) ir elektroporuojama stačiakampio formos elektriniais impulsais, tada suspensija išsiurbiama ir talpinama į švarius 1,5 ml mėgintuvėlius. Viskas inkubuojama 10 min. kambario temperatūroje. Praėjus nustatytam inkubacijos laikui, 40 µl ląstelių suspensijos (~ 72000 ląstelių) išsėjama į 35 mm skersmens petri lėkšteles (Greiner Bione, Vokietija) su 2 ml augimo terpės (į kurią įdėtas dengiamasis 18×18 mm stikliukas). Lėkštelės švelniai pajudinamos, kad ląstelės geriau pasiskirstytų. Ant dengiamųjų stikliuku pasėtos ląstelės auginamos 1 parą inkubatoriuje. DNR elektropernašos efektyvumas nustatomas fluorescenciniu mikroskopu (Motic, Vokietija). Kiekvienam stikliukui padaromos 8 nuotraukos iš atsitiktinai parenkamų stiklelio vietų. Iš pradžių fotografuojama fluorescencinėje šviesoje, vėliau tas pats kadras fotografuojamas taikant šviesinio mikroskopo režimą (11 pav.). Skaičiuojamas fluorescuojančių bei užaugusių ląstelių skaičius, po to apskaičiuojamas vidurkis ir atidedamas procentais grafike. Ląstelės apskaičiuojamos naudojant Image tool kompiuterinę programą. Kontrolė lyginama su išlikusiomis gyvybingomis ląstelėmis ir švytinčiomis transfekuotomis ląstelėmis. Iš gyvybingų ląstelių apskaičiuojamas transfekuotų ląstelių skaičius procentais. Gauti eksperimentų duomenys apdorojami naudojant Microsoft Excel kompiuterinę programą. Grafikuose duomenys pateikiami, kaip vidurkis ± SEM. Duomenų skirtumo patikimumo įvertinimui naudotas Stjudento t-testas. t-testo įvertinimui buvo imti duomenys iš 3 atskirai padarytų eksperimentų. Grafikai sudaromi naudojant Sigma Plot grafinę programą. 11 pav. GFP elektropernašos į CHO ląsteles nustatymas. Kairėje (A) matoma ląstelių monosluoksnio nuotrauka, užfiksuota šviesiniu mikroskopu; dešinėje (B) – ląstelių monosluoksnio nuotrauka, kurioje matomos švytinčios ląstelės, užfiksuota fluorescenciniu mikroskopu. 2.3.2. Liuciferazę koduojančios plazmidės elektropernašos į CHO ląsteles nustatymas Ląstelės suspenduojamos eksperimentinėje mažo laidumo terpėje (10 mM fosfato, 250 mM sacharozės, 1 mM MgCl2, pH 7.2). Taip paruošiama ląstelių suspensija, kurios tankis – 2 x 106 ląstelių/ml. Į 1,5 ml mėgintuvėlius (Eppendorf Research, SAFE-LOCK) įdedama 5 μl GFP ir 45 μl paruoštos ląstelių suspensijos. Toks 50 μl lašas talpinamas tarp dviejų plokštelinių elektrodų (atstumas 2 mm) ir elektroporuojama stačiakampio formos elektriniais impulsais, tada suspensija išsiurbiama ir talpinama į švarius 1,5 ml mėgintuvėlius. Viskas inkubuojama 10 min. kambario temperatūroje. Praėjus nustatytam inkubacijos laikui, 5,56 µl ląstelių suspensijos (~ 10000 ląstelių) išsėjama į 96 šulinėlių plokštelę (Greiner Bione, Vokietija) su 100 μl augimo terpės DMEM. Pasėtos ląstelės auginamos 1 parą inkubatoriuje. Praėjus nustatytam auginimo laikui, iš šulinėlių nusiurbiama po 75 µl auginimo terpės DMEM, ir įpilama po 100 µl liuciferino ir ląstelių lizavimo buferio mišinio (ONE-Glo™ Luciferase Assay System, Promega). Po 3 min. liuminometru (TECAN, Genios Pro, Austrija) matuojama ląstelių suspensijos liuminescencija. Gauti eksperimentų duomenys apdorojami naudojant Microsoft Excel kompiuterinę programą. Grafikuose duomenys pateikiami, kaip vidurkis ± SEM. Duomenų skirtumo patikimumo įvertinimui naudotas Stjudento t-testas. t-testo įvertinimui buvo imti duomenys iš 3 atskirai padarytų eksperimentų. Grafikai sudaromi naudojant Sigma Plot grafinę programą. 2.3.3. Ląstelių gyvybingumo nustatymas taikant ląstelių kolonijų testą Eksperimentų eigoje, po elektroporuotos ląstelių suspensijos inkubacinio 10 min. periodo, ~ 500 ląstelių išsėjama į 35 mm skersmens petri lėkšteles (Greiner Bione, Vokietija) su 2 ml augimo terpės DMEM. Ląstelės talpinamos į inkubatorių ir auginamos 6 – 7 paras. Praėjus šiam laikotarpiui iš lėkštelių pašalinama augimo terpė, o susiformavusios ląstelių kolonijos fiksuojamos 96% etanoliu. Po 15 min. etanolis nupilamas, lėkštelės praplaunamos šaltu vandeniu ir dažomos gram kristalo violeto (gram crystal violet) tirpalu (Sigma) 15 min. Po to petri lėkštelės vėl plaunamos šaltu vandeniu ir džiovinamos mažiausiai 24 valandas. Ląstelių kolonijos skaičiuojamos naudojant binokuliarą (MƂC – 9, Rusija). Įvertinamas ląstelių gyvybingumas procentais lyginant su kontroline grupe. 3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 3.1. Skirtingų laiko tarpų tarp 1HV ir 1LV elektrinių impulsų poveikis liuciferazę koduojančios plazmidės elektropernašai į CHO ląsteles Šiuose DNR elektropernašos efektyvumo tyrimo eksperimentuose buvo naudojama liuciferazę koduojanti plazmidė. Norint geriau įvertinti skirtingų laiko tarpų tarp 1HV ir 1LV impulsų poveikį DNR elektropernašos efektyvumui į Kinijos žiurkėno kiaušidžių ląsteles (CHO), eksperimentuose naudojome skirtingą DNR plazmidžių koncentraciją – 10 µg/ml, 50 µg/ml ir 100 µg/ml. Plazmidė buvo įdėta į ląstelių suspensiją prieš paveikiant ją stačiakampio formos elektriniais impulsais. Tyrimuose taikyti elektrinių impulsų parametrai: 1HV – 1200 V/cm, 100 µs; 1LV – 100 V/cm, 100 ms. Pasirinkti laiko tarpai tarp impulsų – 1 µs, 10 µs, 100 µs, 1 ms, 10 ms, 100 ms ir 1 s. Histogramose duomenys pateikiami, kaip vidurkis tarp 3 atliktų eksperimentų ± SEM (standartinė vidurkio paklaida). Duomenų skirtumo patikimumo įvertinimui naudotas stjudento t-testas. t-testo įvertinimui buvo imti duomenys iš 3 atliktų eksperimentų. Duomenys patikimai skyrėsi, kai p [Žiūrėta 2011-11-23]. 4. Kirvelis D. Biofizika., Vilnius, Vilniaus universiteto leidykla. (2007), 423. 5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. (2003), 437-447. 6. Dimitrov D.S. Electroporation and Electrofusion of Membranes. Central Laboratory of Biophysics, Bulgarian Academy of Sciences, Sofia, Bulgaria, Elsevier Science B.V. (1995), 851. 7. Kinosita, K., Hibino M., Itoh H., Shigemori M., Hirano K., Kirino Y. and Hayakawa T. Events of membrane electroporation visualized on a time scale from microsecond to seconds, in: Guide to Electroporation and Electrofusion, eds D.C. Chang, B.M. Chassy, J.A. Saunders and A.E. Sowers (Academic Press, Orlando). (1992), 29–46. 8. Pohl, H.A. Dielectrophoresis (Cambridge Univ. Press, London). (1978) 9. Pavlin M., Pavšelj N., Miklavčič D. Electroporation in dense cell suspension – theoretical and experimental analysis of ion diffusion and cell permeabilization. Biochimica et Biophysica Acta (2007), 1770: 12–23. 10. Pavlin M., Pavšelj N., Miklavčič D. Dependence of induced transmembrane potential on cell density, arrangement and cell position inside a cell system. IEEE Trans. Biomed. Eng. (2002), 49: 605–612. 11. Schwister K., Deuticke B. Formation and properties of aqueous leaks induced in human erythrocytes by electrical breakdown. Biochim. Biophys. Acta (1985), 816: 332–348. 12. Schoenbach, K.H., Beebe, S.J. & Buescher, E.S. Intracellular effect of ultrashort electrical pulses. Bioelectromagnetics (2001), 22: 440–448. 13. Gabriel, B. & Teissie, J. Direct observation in the millisecond time range of fluorescent molecule asymmetrical interaction with the electropermeabilized cell membrane. Biophys J (1997), 73: 2630–2637. 14. Tekle, E., Astumian, R.D. & Chock, P.B. Electro-permeabilization of cell membranes: effect of the resting membrane potential. Biochem Biophys Res Commun (1990), 172: 282–287. 15. Kinosita K. and Tsong T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. (1977a), 471: 227-242. 16. Kinosita K. and Tsong T. Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature. (1977b), 268: 438-441. 17. Saulis G., Venslauskas M.S., and Naktinis J. Kinetics of pore resealing in cell membranes after electroporation. Bioelectrochem. Bioenerg. (1991), 26: 1-13. 18. Kinosita, K.Jr. and Tsong T.Y. Formation and resealing of pores of controlled sizes in human erythrocyte membrane. Nature (1977), 268: 438–441. 19. Serpersu, E.H., Kinosita Jr.K. and Tsong T.Y. Reversible and irreversible modification of erythrocyte membrane permeability by electric field. Biochim. Biophys. Acta (1985), 812:779–785. 20. Bryant, G. and Wolfe J. Electromechanical stresses produced in the plasma membranes of suspended cells by applied electric fields. J. Membr. Biol. (1987), 96: 129–139. 21. Dimitrov, D.S. Electrical breakdown of lipid bilayers and cell membranes – a thin viscoelastic film model. J. Membr. Biol. (1984), 78: 53–60. 22. Dimitrov, D.S. and Jain R.K. Membrane stability. Biochim. Biophys. (1984), 779: 437–468. 23. Needham, D. and Hochmuth R.M. Electro-mechanical permeabilization of lipid vesicles: Role of membrane tension and compressibility, Biophys. J. (1989), 55: 1001–1009. 24. Dimitrov D.S., Zhelev D.V. and Jain R.K. Stability of viscoelastic membrane systems modeled as multilayered thin films. J. Theoret. Biol. (1985), 113: 353–377. 25. Abidor, I.G., Arakelyan V.B., Chernomordik L.V., Chizmadzhev Yu.A., Pastushenko V.F. and Tarnsevich M.R. Electrical breakdown of bilayer lipid membranes, I. The main experimental facts and their qualitative discussion. Bioelectrochem. Bioenerg. (1979), 6: 37–52. 26. Saulis G., Šatkauskas S. Electroporation of biological membranes. Vytautas Magnus University, Kaunas, Lithuania. Veterinarija ir zootechnika. (2004), T. 26 (48). 27. Glaser R.W., Leikin S.L., Chernomordik L.V., Pastushenko V.F., and Sokirko A.I. Reversible electrical breakdown of lipid bilayers: formation and evolution of pores. Biochim. Biophys. Acta. (1988), 940: 275-287. 28. Kashchiev, D. and Exerova D. Bilayer lipid membrane permeation and rupture due to hole formation. Biochim. Biophys. Acta (1983), 732: 133–145. 29. Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., & Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO Journal (1982), 1, 841–845. 30. Jean-Michel Escoffre, Thomas Portet, Luc Wasungu, Justin Teissie, David Dean, Marie-Pierre Rols. What is (Still not) Known of the Mechanism by Which Electroporation Mediates Gene Transfer and Expression in Cells and Tissues Mol Biotechnol (2009), 41:286–295 31. Hristova, N. I., Tsoneva, I., Neumann, E. Sphingosinemediated electroporative DNA transfer through lipid bilayers. FEBS Letters (1997), 415, 81–86. 32. Spassova, M., Tsoneva, I., Petrov, A. G., Petkova, J. I., Neumann, E. Dip patch clamp currents suggest electrodiffusive transport of the polyelectrolyte DNA through lipid bilayers. Biophysical Chemistry (1994), 52, 267–274. 33. Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L.V., Chizmadzhev Yu, A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophysical Journal(1991), 60, 804–811. 34. Muller, K. J., Horbaschek, M., Lucas, K., Zimmermann, U., Sukhorukov, V. L. Electrotransfection of anchoragedependent mammalian cells. Experimental Cell Research (2003), 288, 344–353. 35. Bureau, M. F., Gehl, J., Deleuze, V., Mir, L. M., & Scherman, D. Importance of association between permeabilization and electrophoretic forces for intramuscular DNA electrotransfer. Biochimica et Biophysica Acta (2000). 1474, 353–359. 36. Vaughan, E. E., & Dean, D. A. Intracellular trafficking of plasmids during transfection is mediated by microtubules. Molecular Therapy (2006), 13, 422–428. 37. Takahashi, M., Furukawa, T., Nikkuni, K., Aoki, A., Nomoto, N., Koike, T., et al. Efficient introduction of a gene into hematopoietic cells in S-phase by electroporation. Experimental Hematology (1991), 19, 343–346. 38. Teissie J, Golzio M, Rols MP. Mechanisms of cell membrane permeabilization: a minireview of our present (lack of?) knowledge. Biochim Biophys Acta (2005), 1724: 270–280. 39. Phez E, Faurie C, Golzio M, et al. New insights in the visualization of membrane permeabilization and DNA/membrane interaction of cells submitted to electric pulses. Biochim Biophys Acta (2005), 1724: 248–254. 40. Golzio M, Teissie J, Rols MP. Direct visualization at the singlecell level of electrically mediated gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: 1292–1297. 41. Sukharev SI, Klenchin VA, Serov SM, et al. Electroporation and electrophoretic DNA transfer into cells. The effect of DNA interaction with electropores. Biophys J (1992), 63: 1320–1327. 42. Tarek M. Membrane electroporation: a molecular Dynamics simulation. Biophys J (2005), 88: 4015–4053. 43. Faurie C, Phez E, Golzio M, et al. Effect of electric field vectoriality on electrically mediated gene delivery in mammalian cells. Biochim Biophys Acta (2004), 1665: 92–100. 44. Rebersek M, Faurie C, Kanduser M, et al. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in vitro. Biomed Eng Online (2007), 2: 6–25. 45. Matej Reberšek, Cécile Faurie, Maša Kandušer, Selma Жorović, Justin Teissié, Marie-Pierre Rols, Damijan Miklavčič. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. BioMedical Engineering OnLine (2007), 6:25 46. Mir L. M., Tounekti O., and Orlowski S. Bleomycin: revival of an old drug. Gen. Pharmac. (1996), 27(5): 745-748. 47. Moeller Antje, Ask Kjetil, Warburton David, Gauldie Jack, Kolb Martin. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis. Int J Biochem Cell Biol. (2008), 40(3): 362–382. 48. Šatkauskas S., Keršienė R., Didžiapetrienė J., Venslauskas M. Antinavikinio elektrochemoterapijos efektyvumo įvertinimas gydant plaučių epidermoidinę karcinomą LL in vivo. Vytauto Didžiojo universitetas, Lietuvos onkologijos centras. (1998), 34: 668-673. 49. Pucihar G., Kotnik T., Miklavčič D., Teissié J. Kinetics of Transmembrane Transport of Small Molecules into Electropermeabilized Cells. Biophys J. (2008), 95(6): 2837–2848. 50. Michael J Whalen, Turgay Dalkara, Zerong You1, Jianhua Qiu, Daniela Bermpoh, Niyati Mehta, Bernhard Suter, Pradeep G Bhide, Eng H Lo, Maria Ericsson, and Michael A Moskowitz. Acute plasmalemma permeability and protracted clearance of injured cells after controlled cortical impact in mice. (2008), 28(3): 490–505. 51. Haritou M., Yova D., Koutsouris D., and Loukas S. A study on transient membrane permeabilisation and cell fusion induced by electric field. In Proceedings of the 44 th 83 scientific conference of the hellenic biochemical and biophysical society, Newsletter. (1996), 40: 93-94. 52.

Daugiau informacijos...

★ Klientai rekomenduoja

Šį rašto darbą rekomenduoja mūsų klientai. Ką tai reiškia?

Mūsų svetainėje pateikiama dešimtys tūkstančių skirtingų rašto darbų, kuriuos įkėlė daugybė moksleivių ir studentų su skirtingais gabumais. Būtent šis rašto darbas yra patikrintas specialistų ir rekomenduojamas kitų klientų, kurie po atsisiuntimo įvertino šį mokslo darbą teigiamai. Todėl galite būti tikri, kad šis pasirinkimas geriausias!